ADN monocatenario multicopia

El ADN monocatenario multicopia (msDNA) es un tipo de ADN satélite extracromosómico que consiste en una molécula de ADN monocatenario unida covalentemente mediante un enlace fosfodiéster 2'-5' a una guanosina interna de una molécula de ARN . La quimera de ADN/ARN resultante posee dos bucles de tallo unidos por una ramificación similar a las ramificaciones que se encuentran en los intermediarios del empalme de ARN . La región codificante del msDNA, denominada " retrón ", también codifica un tipo de transcriptasa inversa , esencial para la síntesis de msDNA. ^{[ 2 ]}

Antes del descubrimiento del msDNA en mixobacterias , ^{[ 3 ] [ 4 ]} un grupo de bacterias que se desplazan en enjambres y habitan en el suelo , se creía que las enzimas conocidas como transcriptasas inversas (RT) existían solo en eucariotas y virus . El descubrimiento impulsó la investigación en este campo. Investigaciones posteriores revelaron similitudes entre la transcriptasa inversa codificada por el VIH y un marco de lectura abierto (ORF) presente en la región codificante del msDNA. Las pruebas confirmaron la presencia de actividad de transcriptasa inversa en lisados ​​crudos de cepas que contenían retron. ^{[ 5 ]} Aunque se identificó tentativamente un dominio de RNasa H en el ORF del retron, posteriormente se descubrió que la actividad de RNasa H necesaria para la síntesis de msDNA la proporciona el huésped. ^{[ 6 ]}

El descubrimiento del msDNA ha dado lugar a preguntas más amplias sobre el origen de la transcriptasa inversa, ya que se han encontrado genes que codifican la transcriptasa inversa (no necesariamente asociados con el msDNA) en procariotas, eucariotas, virus e incluso arqueas . Después de que se descubriera un fragmento de ADN que codifica la producción de msDNA en E. coli , ^{[ 7 ]} se conjeturó que los bacteriófagos podrían haber sido responsables de la introducción del gen RT en E. coli . ^{[ 8 ]} Estos descubrimientos sugieren que la transcriptasa inversa desempeñó un papel en la evolución de los virus a partir de bacterias, con una hipótesis que afirma que, con la ayuda de la transcriptasa inversa, los virus podrían haber surgido como un gen de msDNA que se separó y adquirió una cubierta proteica. Dado que casi todos los genes RT funcionan en la replicación de retrovirus y/o el movimiento de elementos transponibles , es razonable imaginar que los retrones podrían ser elementos genéticos móviles, pero ha habido poca evidencia que respalde tal hipótesis, salvo el hecho observado de que el msDNA está ampliamente aunque esporádicamente disperso entre especies bacterianas de una manera que sugiere tanto transferencia horizontal como vertical. ^{[ 9 ] [ 10 ]} Dado que no se sabe si las secuencias de retrones per se representan elementos móviles, los retrones se definen funcionalmente por su capacidad de producir msDNA mientras se evita deliberadamente especular sobre otras posibles actividades.

Se han predicho miles de retrones bioinformáticamente en genomas bacterianos. ^{[ 11 ]} Sin embargo, durante casi cuatro décadas desde su descubrimiento, se desconocía la función del msDNA/retrones, a pesar de que existen muchas copias dentro de las células. Los primeros estudios mostraron que las mutaciones de inactivación que no expresan msDNA son viables, por lo que la producción de msDNA no es esencial para la vida en condiciones de laboratorio. La sobreexpresión de msDNA es mutagénica, aparentemente como resultado de la titulación de proteínas de reparación por los pares de bases mal emparejados que son típicos de su estructura. ^{[ 9 ]} Se sugirió que el msDNA podría tener algún papel en la patogenicidad ^{[ 12 ]} o en la adaptación a condiciones de estrés. ^{[ 13 ]}

La comparación de secuencias de msDNA de Myxococcus xanthus , Stigmatella aurantiaca ^{[ 1 ]} y muchas otras bacterias ^{[ 13 ]} reveló dominios conservados e hipervariables que recuerdan a las secuencias conservadas e hipervariables encontradas en moléculas de alorreconocimiento ^{[ 14 ]} . Los principales msDNA de M. xanthus y S. aurantiaca , por ejemplo, comparten un 94% de homología de secuencia, excepto dentro de un dominio de 19 pares de bases que comparte una homología de secuencia de solo el 42% ^{[ 1 ]} . La presencia de tales dominios es significativa porque las mixobacterias exhiben comportamientos sociales cooperativos complejos, incluyendo enjambres y la formación de cuerpos fructíferos, mientras que E. coli y otras bacterias patógenas forman biopelículas que exhiben una mayor resistencia a antibióticos y detergentes. La sostenibilidad de los ensamblajes sociales que requieren una inversión individual significativa de energía generalmente depende de la evolución de mecanismos de alorreconocimiento que permiten a los grupos distinguir entre lo propio y lo ajeno ^{[ 15 ] .}

Otras propuestas especulativas sobre la amplia distribución de los retrones incluyen la idea de que podrían ser elementos genéticos egoístas, ^{[ 16 ]} podrían estar involucrados en la respuesta de inanición de una bacteria, ^{[ 17 ]} o podrían estar involucrados en la especialización celular. ^{[ 18 ]} Sin embargo, la evidencia de estas funciones propuestas era estrictamente circunstancial. ^{[ 19 ]}

Recientemente, ha habido creciente evidencia de que los retrones pueden desempeñar un papel en la defensa inmunitaria bacteriana contra la infección por fagos, como parte de una unidad defensiva compuesta por tres componentes: la transcriptasa inversa, el precursor de ARN no codificante del msDNA (ARNnc) y una proteína efectora. ^{[ 19 ]} El retron parece "proteger" a RecBCD, que participa en la reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante recombinación homóloga ^{[ 20 ]} y que es una parte central de varios mecanismos de inmunidad antifago en bacterias. Múltiples fagos inhiben RecBCD como parte de su mecanismo infeccioso. Sin embargo, en bacterias que contienen retrones, la inhibición de RecBCD conduce a la activación del retron, lo que resulta en una infección abortiva ( es decir, suicidio bacteriano como respuesta inmunitaria antiviral). ^{[ 21 ] [ 19 ]} Por lo tanto, los retrones proporcionan una línea de defensa de respaldo en situaciones donde la integridad del sistema inmunitario bacteriano está dañada. ^{[ 22 ]}

Se postula que la biosíntesis de msDNA sigue una vía única que no se encuentra en ningún otro lugar de la bioquímica del ADN/ARN. Debido a la similitud de la unión de ramificación 2'-5' con las uniones de ramificación que se encuentran en los intermediarios del empalme del ARN, en un principio se podría haber esperado que la formación de ramificaciones se produjera mediante la ligación mediada por el espliceosoma o la ribozima . Sin embargo, sorprendentemente, experimentos en sistemas libres de células que utilizan transcriptasa inversa de retron purificada indican que la síntesis de cDNA se inicia directamente a partir del grupo 2'-OH del residuo G interno específico del ARN cebador. ^{[ 23 ]} La RT reconoce estructuras de tallo-bucle específicas en el ARN precursor, lo que hace que la síntesis de msDNA por la RT sea altamente específica para su propio retron. ^{[ 24 ]} El cebado de la síntesis de msDNA ofrece un desafío fascinante para nuestra comprensión de la síntesis de ADN. Las ADN polimerasas (que incluyen la RT) comparten características estructurales altamente conservadas, lo que significa que sus sitios catalíticos activos varían poco de una especie a otra, o incluso entre las ADN polimerasas que usan ADN como molde, y las que usan ARN como molde. La región catalítica de la transcriptasa inversa eucariota comprende tres dominios denominados "dedos", "palma" y "pulgar" que sostienen el cebador-molde de doble cadena en un agarre de mano derecha con el 3'-OH del cebador enterrado en el sitio activo de la polimerasa, ^{[ 25 ]} un grupo de residuos ácidos y polares altamente conservados situados en la palma entre lo que serían los dedos índice y medio. En las RT eucariotas, el dominio RNasa H se encuentra en la muñeca debajo de la base del pulgar, pero las RT retronas carecen de actividad RNasa H. La hendidura de unión al ácido nucleico, que se extiende desde el sitio activo de la polimerasa hasta el sitio activo de la RNasa H, tiene aproximadamente 60 Å de longitud en las RT eucariotas, lo que corresponde a casi dos vueltas helicoidales. ^{[ 26 ]} Cuando la RT eucariota extiende un cebador convencional, la doble hélice de ADN/ARN en crecimiento se enrolla en espiral a lo largo de la hendidura, y a medida que la doble hélice pasa el dominio de la RNasa H, el ARN molde se digiere para liberar la hebra naciente de ADNc. Sin embargo, en el caso de la extensión del cebador de msDNA, una hebra larga de ARN permanece unida al 3'-OH de la G de cebado. Aunque es posible modelar un complejo RT-plantilla de cebador que haría accesible el 2'-OH para la reacción de cebado, ^{[ 24 ]} la extensión adicional de la hebra de ADN presenta un problema: a medida que progresa la síntesis de ADN, la voluminosa hebra de ARN que se extiende desde el 3'-OH necesita de alguna manera enrollarse hacia abajo en la hendidura de unión sin ser bloqueada por impedimento estérico.Para superar este problema, la transcriptasa inversa de msDNA requeriría claramente características especiales que no comparten otras RT. ^{[ 9 ]}

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• Zimmerly, Steven (2005). «Intrones móviles y retroelementos en bacterias». En Mullany, Peter (ed.). El genoma bacteriano dinámico . Avances en microbiología molecular y celular. Vol.  8. Cambridge University Press. pp. 121–148 . doi : 10.1017/CBO9780511541544.004 . ISBN  978-0-511-54154-4.
• Furuichi, T., Dhundale, A., Inouye, M., y Inouye, S. ARN ramificado unido covalentemente al extremo 5' de un ADN monocatenario en Stigmatella aurantiaca: estructura del msDNA. Cell 48:47-53, 1987 doi: 10.1016/0092-8674(87)90354-0.