Purificación por gradiente de solvente a contracorriente en múltiples columnas

La purificación por gradiente de solvente a contracorriente en múltiples columnas ( MCSGP ) es una forma de cromatografía que se utiliza para separar o purificar biomoléculas de mezclas complejas. Fue desarrollada en el Instituto Federal Suizo de Tecnología de Zúrich por Aumann y Morbidelli. ^{[ 1 ]} El proceso consiste en dos a seis columnas cromatográficas conectadas entre sí de tal manera que, a medida que la mezcla se desplaza a través de las columnas, el compuesto se purifica en varias fracciones.

El proceso MCSGP consta de varias columnas cromatográficas, al menos dos, que se intercambian en posición opuesta a la dirección del flujo. La mayoría de las columnas están equipadas con una bomba de gradiente para ajustar la concentración del modificador en la entrada de la columna. Algunas columnas están conectadas directamente, de modo que las corrientes de producto no puro se reciclan internamente. Otras columnas están en cortocircuito, de modo que operan en modo discontinuo puro. El sistema se divide en varias secciones, cada una de las cuales realiza tareas análogas a las de una purificación por lotes. Estas tareas son: carga de la alimentación, ejecución de la elución por gradiente, reciclaje de fracciones de sitios de adsorción débil, fraccionamiento del producto purificado, reciclaje de fracciones de sitios de adsorción fuerte, limpieza de la columna de impurezas de adsorción fuerte, limpieza in situ y reequilibrio de la columna para iniciar la siguiente ejecución de purificación. Todas las tareas mencionadas se llevan a cabo simultáneamente en una sola unidad. El reciclaje de fracciones laterales no puras se realiza en contracorriente.

Las biomoléculas se purifican frecuentemente mediante cromatografía por lotes con gradiente de solvente . En este proceso, se aplican gradientes de solvente lineales y suaves para controlar cuidadosamente la separación entre el componente deseado y cientos de impurezas. El producto deseado suele ser intermedio entre impurezas de baja y alta absorción. Se requiere un corte central para obtener el producto puro deseado. A menudo, las resinas preparativas presentan una baja eficiencia debido a la fuerte dispersión axial y la lenta transferencia de masa . Por lo tanto, no es posible la purificación en una sola etapa cromatográfica. Se requeriría un movimiento a contracorriente , como el conocido en el proceso SMB . Para producciones a gran escala y para moléculas muy valiosas, es necesario aplicar un movimiento de sólidos a contracorriente para aumentar la eficiencia de separación, el rendimiento y la productividad de la purificación. El proceso MCSGP combina ambas técnicas en un solo proceso: el principio SMB a contracorriente y la técnica de lotes con gradiente de solvente.

El modo discontinuo consta de etapas de equilibración, carga, lavado, purificación y regeneración. Este modo de operación permite aprovechar las ventajas de los gradientes de solvente, pero implica un alto consumo de solvente y una baja productividad en comparación con los procesos continuos a contracorriente. Un proceso consolidado de este tipo es la técnica de lecho móvil simulado (SMB), que requiere las etapas de equilibración, lavado y regeneración, que consumen solvente, solo una vez por operación y presenta una mejor utilización de la resina. Sin embargo, las principales desventajas de la SMB son la incapacidad de separar una mezcla en tres fracciones y la falta de aplicabilidad de gradientes de solvente. En el caso de los anticuerpos, la técnica más avanzada se basa en la cromatografía de afinidad por lotes (con proteína A o proteína G como ligandos), capaz de unirse selectivamente a las moléculas de anticuerpos. En general, las técnicas de afinidad tienen la ventaja de purificar biomoléculas con altos rendimientos y purezas, pero sus desventajas suelen ser el alto costo de la fase estacionaria, la lixiviación del ligando y la menor capacidad de limpieza.

El proceso MCSGP puede generar purezas y rendimientos comparables a los de la purificación con proteína A. El segundo ejemplo de aplicación del prototipo MCSGP es la separación de tres variantes de anticuerpos monoclonales (AcM) mediante una resina de intercambio catiónico débil preparativa. Si bien la variante de AcM de elución intermedia solo se puede obtener con una pureza del 80 % y recuperaciones cercanas a cero en un proceso cromatográfico por lotes, el proceso MCSGP puede proporcionar una pureza del 90 % con un rendimiento del 93 %. Se realizó una comparación numérica del proceso MCSGP con el proceso cromatográfico por lotes, y con un proceso cromatográfico por lotes que incluye un reciclaje ideal, utilizando como sistema modelo la purificación industrial de polipéptidos. Esta comparación muestra que el proceso MCSGP puede aumentar la productividad en un factor de 10 y reducir el requerimiento de solvente en un 90 %. ^{[ 2 ]}

Las principales ventajas de la cromatografía por lotes con gradiente de solvente son los altos rendimientos, incluso para separaciones difíciles; el menor consumo de solvente; la mayor productividad; y el uso de movimiento de sólidos a contracorriente, que aumenta la eficiencia de la separación. El proceso es continuo. Una vez alcanzado el estado estacionario, proporciona un producto purificado de forma continua, con calidad y cantidad constantes. Incorpora limpieza automática in situ. Es posible un diseño empírico de las condiciones de operación a partir de un único cromatograma por lotes con gradiente de solvente.

Todas las purificaciones y separaciones cromatográficas que se realizan mediante cromatografía por lotes con gradiente de solvente pueden llevarse a cabo utilizando MCSGP. Ejemplos típicos son la purificación de péptidos en fase inversa , la cromatografía de interacción hidrofóbica para ácidos grasos o, por ejemplo, la cromatografía de intercambio iónico de proteínas o anticuerpos . El proceso puede enriquecer eficazmente componentes que se han introducido en pequeñas cantidades. La captura continua de anticuerpos sin cromatografía de afinidad puede realizarse con el proceso MCSGP. ^{[ 3 ]}