Análisis de genética evolutiva molecular

Editor de Alineamientos — Dentro de MEGA, el Editor de Alineamientos es una herramienta que se puede usar para editar y crear alineamientos de secuencias múltiples. El Editor de Alineamientos de MEGA incluye una herramienta integrada para los programas ClustalW y MUSCLE. Todas las acciones se realizan en el Explorador de Análisis, que se encuentra en el menú principal de MEGA. Al crear un nuevo alineamiento, el usuario tiene tres opciones: crear un nuevo alineamiento, abrir una sesión de alineamiento guardada o recuperar secuencias de un archivo (importando secuencias de NCBI). Una vez seleccionada una opción, el usuario puede elegir ClustalW o MUSCLE en la pestaña Alineamiento, ubicada en la parte superior de la página. A continuación, se pueden especificar los parámetros para el programa de alineamiento seleccionado y aparecerá una barra de progreso mientras se procesa la herramienta. Las secuencias alineadas reemplazarán a las no alineadas en la sección principal del Editor de Alineamientos. Para realizar análisis adicionales en MEGA, es recomendable guardar la sesión de alineamiento en formato MEGA o FASTA . ^{[ 5 ]}

Visor/Editor de archivos de datos de rastreo ― El visor/editor de archivos de datos de rastreo cuenta con numerosas funcionalidades en los siguientes tres menús. Todos los comandos se utilizan para ayudar a especializar las búsquedas y alineaciones en MEGA.

• El menú Datos consta de Abrir archivo en una ventana nueva, Abrir archivo, Guardar archivo, Imprimir, Agregar a Explorador de alineación, Exportar archivo FASTA y Salir. ^{[ 6 ]}
• El menú Editar consta de Deshacer, Copiar, Enmascarar aguas arriba, Enmascarar aguas abajo e Invertir complemento. La diferencia entre Enmascarar aguas arriba y Enmascarar aguas abajo radica en que Enmascarar aguas arriba se utiliza para enmascarar/desenmascarar una región a la izquierda del cursor, mientras que Invertir complemento hace lo contrario. Invertir complemento se utiliza en situaciones donde es necesario invertir los complementos en una secuencia. ^{[ 6 ]}
• El menú de búsqueda consta de Buscar, Buscar siguiente, Buscar anterior, Siguiente N, Buscar en archivo y Realizar búsqueda BLAST. Las opciones Buscar, Buscar siguiente y Buscar anterior se utilizan para encontrar coincidencias en secciones específicas de una secuencia de consulta. Siguiente N es un comando que permite avanzar al siguiente nucleótido indeterminado (N). Buscar en archivo permite al usuario buscar secuencias seleccionadas en otro archivo. El comando Realizar búsqueda BLAST realiza una búsqueda BLAST en un navegador web independiente. El usuario puede seleccionar una fecha específica para la búsqueda BLAST o bien utilizar todas las secuencias de la sesión. ^{[ 6 ]}

Navegador web integrado, obtención de secuencias: MEGA incluye un navegador web integrado que permite a los usuarios acceder a los datos de secuencias de GenBank desde el sitio web del NCBI. Se puede acceder al navegador web integrado al crear una nueva alineación en el Editor de alineaciones. Para utilizar correctamente las secuencias del NCBI, se recomienda cambiar las búsquedas al formato FASTA y usar el botón "Añadir a la alineación". Una vez completado, todas las secuencias se importarán a la aplicación MEGA. ^{[ 7 ]}

Alineamiento de secuencias múltiples

Uno de los desafíos asociados con el análisis genético evolutivo es la presencia de estados ambiguos como R, Y y T. Estos estados suelen surgir de errores de secuencia o conjuntos de datos incompletos. Sin embargo, MEGA ofrece varios recursos para manejar estados ambiguos, incluyendo la eliminación de sitios que tienen una puntuación de ambigüedad superior al parámetro de umbral de cobertura de sitio. ^{[ 8 ]}

El formato extendido de MEGA permite a los usuarios guardar todos los atributos de datos, como la longitud de la secuencia, las posiciones de los nucleótidos, los huecos y los estados ambiguos. ^{[ 9 ]} Además, MEGA admite la importación de datos desde otros formatos, como Clustal, lo que garantiza una transición fluida entre los tipos de archivo más populares. ^{[ 10 ]}

Tras importar un conjunto de datos, MEGA ofrece diversas opciones de visualización. Por ejemplo, los usuarios pueden ver atributos estadísticos y seleccionar subconjuntos en el Explorador de datos de secuencias o utilizar el Explorador de datos de distancia para inspeccionar datos de distancia por pares. ^{[ 11 ]} Otra característica de MEGA es la especificación visual de grupos de dominios. Esto permite a los usuarios agrupar secuencias por una característica específica y visualizar los árboles filogenéticos resultantes .

MEGA ofrece soporte para modificar el código genético utilizado para traducir secuencias de ADN. Por defecto, MEGA incluye 23 variantes de código genético, entre ellas el código estándar , el código mitocondrial de vertebrados , el código mitocondrial de Drosophila y el código mitocondrial de levadura . ^{[ 12 ]} Los usuarios pueden añadir, eliminar o editar cualquier tabla de código genético.

Además, MEGA también puede calcular la degeneración de cada posición de codón en una tabla de código genético, así como el número de sitios sinónimos y no sinónimos utilizando el método de Nei-Gojobori. ^{[ 13 ]}

El Experto en Capturas forma parte de MEGA y proporciona subtítulos detallados, similares a los de una publicación, basados ​​en las propiedades de los resultados del análisis. Es una herramienta que puede utilizarse para matrices de distancias, filogenia, pruebas, etc., dentro de MEGA (megasoftware). ^{[ 15 ]}

El editor de archivos de texto integrado de MEGA permite a los usuarios editar archivos de texto sin necesidad de otro programa. Funciones como la selección y edición de bloques en columnas facilitan la realización de operaciones masivas, como el cambio de mayúsculas/minúsculas o el tamaño de la fuente. Además, el editor incluye números de línea para ayudar a navegar por archivos grandes e identificar áreas de interés. ^{[ 16 ]}

MEGA también proporciona varias herramientas para formatear secuencias. Por ejemplo, la utilidad integrada de complemento inverso invierte el orden de los caracteres y reemplaza cada uno con su complemento. ^{[ 17 ]}

Las capturas de pantalla muestran el uso de la herramienta de complemento inverso de MEGA. La secuencia original se invirtió y cada nucleótido se reemplazó por su complemento para producir el complemento inverso.

MEGA proporciona una interfaz gráfica para visualizar y manipular secuencias de nucleótidos y proteínas alineadas. ^{[ 18 ]} El Explorador de datos de secuencias tiene múltiples funcionalidades de menú para ayudar con la exportación de datos, la búsqueda de alineaciones, el cambio de características de visualización, el resaltado de sitios y el cálculo de estadísticas:

• El menú Datos consta de Escribir datos en archivo, Traducir/Destraducir, Seleccionar tabla de código genético, Configurar/Seleccionar genes y dominios, Configurar/Seleccionar taxones y grupos, Salir del visor de datos. ^{[ 19 ]} Traducir/Destraducir y Seleccionar tabla de código genético solo está disponible para secuencias de nucleótidos.
• El menú de búsqueda consta de Buscar motivo, Buscar siguiente, Buscar anterior, Buscar sitio marcado y Resaltar motivo. ^{[ 20 ]}
• El menú de visualización consta de Mostrar solo secuencias seleccionadas, Usar símbolo idéntico, Colorear celdas, Ordenar secuencias, Restaurar orden de entrada, Mostrar nombre de secuencia, Mostrar nombre de grupo y Cambiar fuente. ^{[ 21 ]}
• El menú de elementos destacados consta de sitios conservados, sitios variables, sitios informativos de parsimonia, sitios únicos, sitios degenerados de orden 0, sitios degenerados de orden 2 y sitios degenerados de orden 4. ^{[ 22 ]}
• El menú de estadísticas consta de Composición de nucleótidos, Frecuencias de pares de nucleótidos, Uso de codones, Composición de aminoácidos, Usar todos los sitios seleccionados, Usar solo los sitios resaltados, Mostrar resultados en hoja de cálculo (Excel o LibreOffice/OpenOffice), Mostrar resultados en formato CSV (delimitado por comas), Mostrar resultados en editor de texto . ^{[ 23 ]}

Los modelos de sustitución en MEGA permiten diversas opciones con diferentes atributos para secuencias de ADN y proteínas. Puede elegir distintos tipos de sustitución, modelos, etc., para que se ajusten mejor a los datos seleccionados. Los tres modelos de sustitución principales son la matriz de tasas 4x4, la relación de tasas de transición-transversión (k1,k2) y el sesgo de la tasa de transición-transversión de R.

Relaciones de tasas de transición-transversión (k1, k2) – La relación de tasas de transición-transversión calcula la relación de tasas de transición (a) a transversión (b) utilizando la fórmula k = a/b. ^{[ 24 ]}

Sesgo de la tasa de transición-transversión (R) — El sesgo de la tasa de transición-transversión R en MEGA calcula la relación entre el número de transiciones y el número de transversiones entre un par de secuencias. MEGA permite al usuario realizar un análisis de los datos con un valor específico de R. Un aspecto clave es que cuando R es igual a 0,5, significa que no hay sesgo hacia ninguna sustitución, ya sea de transición o de transversión. ^{[ 24 ]}

MEGA ofrece varios métodos para evaluar la homogeneidad de los patrones de sustitución, como la distancia de composición, el índice de disparidad y las pruebas de Monte Carlo. Estos métodos se utilizan para determinar si diferentes regiones genéticas evolucionaron bajo la misma presión selectiva.

La distancia computacional mide la variación en la composición de nucleótidos entre dos secuencias. MEGA calcula esta cifra por sitio y excluye cualquier hueco o dato faltante. Una mayor distancia sugiere que las regiones evolucionaron bajo diferentes presiones selectivas. ^{[ 25 ]}

El índice de disparidad evalúa la diferencia en los patrones de sustitución para un par de secuencias dado. Este valor se calcula por sitio y se considera más dinámico que la prueba de chi-cuadrado. Una gran diferencia implica que el patrón de sustitución no fue el mismo para el par de secuencias dado. ^{[ 25 ]}

La prueba de Monte Carlo es otro método para evaluar la homogeneidad del patrón de sustitución, que consiste en ejecutar una simulación de distribución nula. MEGA requiere que el usuario especifique el número de réplicas y una semilla inicial. Para obtener un resultado significativo, es necesario realizar numerosas simulaciones. ^{[ 25 ]} Por lo tanto, es fundamental considerar el costo computacional del algoritmo.

La tabla anterior muestra la complejidad computacional de diferentes métodos de Monte Carlo como${\displaystyle N}$se aproxima al infinito en relación con el parámetro${\displaystyle \alpha }$Aunque no está claro qué método emplea MEGA, es probable que sea computacionalmente intensivo porque todos los métodos enumerados en la tabla tienen un orden computacional mayor que${\displaystyle \Theta (N^{2})}$.

MEGA ofrece una amplia variedad de opciones para calcular la distancia evolutiva entre un par de secuencias de nucleótidos o aminoácidos con o sin errores estándar. ^{[ 27 ]} Los métodos de distancia se dividen en tres categorías: nucleótidos, sinónimos y no sinónimos, y aminoácidos:

• Nucleótido : Las secuencias se comparan nucleótido por nucleótido, disponible tanto para secuencias codificantes de proteínas como para secuencias no codificantes. ^{[ 27 ]}
  • Número de diferencias
  • distancia p
  • Modelo Juke-Cantor
  • Modelo Tajima-Nei
  • Modelo de dos parámetros de Kimura
  • Modelo de Tamura de 3 parámetros
  • Modelo Tamura-Nei
  • Método Log-Det
  • Modelo de máxima verosimilitud compuesta
• Sin-No sinónimos : las secuencias se comparan codón por codón, solo disponible para secuencias codificantes de proteínas. ^{[ 28 ]}
  • Método Nei-Gojobori
  • Método Nei-Gojobori modificado
  • Método Li-Wu-Luo
  • Método de Pamilo-Bianchi-Li
  • Método Kumar
• Aminoácidos : las secuencias se comparan residuo por residuo, disponibles tanto para secuencias codificantes como no codificantes de proteínas. ^{[ 29 ]}
  • Número de diferencias
  • distancia p
  • Modelo de Poisson
  • Modelo de entrada igual
  • Modelo Dayhoff
  • Modelo Jones-Taylor-Thornton

Tras seleccionar un método de distancia, se mostrará un subconjunto de atributos cuando corresponda. Estos atributos son: Sustituciones a incluir, Relación transición/transversión, Patrón entre linajes y Tasas entre sitios. Por ejemplo, si un modelo presenta una variación en la tasa, se mostrará el parámetro gamma. Además, cada método de distancia ofrece opciones para gestionar datos faltantes y huecos, así como la posición del codón, si procede. ^{[ 30 ]}

Cada matriz de sustitución tiene su propio caso de uso. Uno de los modelos más simples es el de Juke-Cantor, que supone tasas de mutación iguales. El modelo de Kimura de 2 parámetros extiende ese modelo pero con distinciones entre las tasas de transición (${\displaystyle A\leftrightarrow G}$y${\displaystyle C\leftrightarrow T}$) y tasas de transversión (${\displaystyle {\phantom {}}_{G}^{A}\leftrightarrow {\phantom {}}_{T}^{C}}$). Luego, el modelo de 3 parámetros de Kimura extiende ese modelo pero con distinciones entre transversiones que conservan la propiedad débil/fuerte del nucleótido (${\displaystyle A\leftrightarrow T}$y${\displaystyle C\leftrightarrow G}$) y transversiones que conservan la propiedad amino/ceto del nucleótido (${\displaystyle A\leftrightarrow C}$y${\displaystyle G\leftrightarrow T}$Sin embargo, cada extensión añade más parámetros y conlleva el riesgo de sobreajuste . La mejor matriz de sustitución depende de los datos utilizados. Para facilitar la selección, MEGA ofrece la opción «Buscar el modelo de sustitución óptimo» en la pestaña «Modelo», que ejecuta cada modelo y asigna una evaluación mediante el criterio de información bayesiano .

Prueba Z para muestras grandes La prueba Z se utiliza para comparar las sustituciones sinónimas y no sinónimas relativas dentro de una secuencia genética, con el objetivo principal de determinar la selección positiva. Para realizar la fórmula de la prueba Z, se debe tener en cuenta una estimación del número de sustituciones sinónimas por sitio sinónimo (dS) y de sustituciones no sinónimas por sitio no sinónimo (dN), junto con las varianzas de las sustituciones sinónimas y no sinónimas Var(dS) y Var(dN). La fórmula utilizada para la prueba Z es:

Z = (dN – dS_ / SQRT(Var(dS) + Var(dN))

Si dN es mayor que dS, indica selección positiva, mientras que si dN es menor que dS, indica selección purificadora. El resultado de Z de la fórmula anterior determinará si se trata de selección positiva o purificadora. Los factores clave para determinar qué tipo de selección será el resultado son las varianzas de los sitios sinónimos y no sinónimos. Estas pruebas se utilizan comúnmente para fórmulas analíticas o remuestreo bootstrap en MEGA. ^{[ 31 ]}

Prueba exacta de Fisher: la prueba exacta de Fisher examina las sustituciones sinónimas y no sinónimas en secuencias y se denomina prueba unilateral cuando se analizan muestras pequeñas para la selección positiva. Se rechaza la hipótesis nula de neutralidad cuando el valor p es menor que 0,05. Si las diferencias por sitio sinónimo superan las de los sitios no sinónimos, MEGA asigna un valor p de 1, lo que indica selección purificadora en lugar de selección positiva. ^{[ 32 ]} Investigación adicional sobre la prueba exacta de Fisher: el algoritmo se basa en la distribución de probabilidad de n!. Como conclusión, se podría argumentar que la complejidad temporal del algoritmo es O(n!). El nombre del método de distribución es Distribución hipergeométrica (Hoffman). ^{[ 33 ]}

Prueba de neutralidad de Tajima: El propósito de la prueba de neutralidad de Tajima es evaluar la relación entre el número de sitios segregantes por sitio y la diversidad de nucleótidos. Cuando los alelos son selectivamente neutros, el producto 4Nv se puede estimar de dos maneras. N representa el tamaño efectivo de la población y v es la tasa de mutación por sitio. Al calcular la diferencia entre estas estimaciones, se puede determinar si existe evidencia de evolución no neutral. ^{[ 34 ]}

La hipótesis del reloj molecular sugiere que todas las secuencias han evolucionado a un ritmo constante a lo largo del tiempo. Por lo tanto, la prueba del reloj molecular evalúa esta afirmación junto con los datos proporcionados por el usuario. En MEGA, esta prueba se realiza aplicando una prueba de máxima verosimilitud a una topología de árbol y una alineación de secuencias dadas. Esto produce dos valores de log-verosimilitud, uno con la hipótesis del reloj y otro sin ella. ^{[ 35 ]}

Otro enfoque ofrecido por MEGA es la prueba de tasa relativa de Tajima . Este método compara el número de sustituciones por sitio entre diferentes secuencias. Si los números resultantes difieren por un factor grande, la hipótesis del reloj molecular puede no ser válida para el conjunto de datos dado. ^{[ 36 ]}

MEGA ofrece cinco métodos para construir un árbol filogenético :

• Un vecino se une
• Evolución mínima
• UPGMA
• Máxima parsimonia
• Máxima probabilidad

Cada método permite realizar una prueba filogenética bootstrap con cualquier número de réplicas. En cambio, el método de unión de vecinos y el de evolución mínima permiten realizar una prueba de ramas internas. El modelo de sustitución y los parámetros son los mismos que los de los métodos de estimación de distancias.

MEGA proporciona una interfaz gráfica para visualizar un árbol filogenético con diversas opciones. En el menú de visualización, el árbol se puede mostrar en tres estilos diferentes: tradicional, de radiación o circular. Los árboles tradicionales tienen tres estilos de ramas: rectangular, recta o curva. El menú de visualización también permite alternar la escala de la topología, cambiar el tipo y tamaño de la fuente, organizar los taxones, mostrar u ocultar diversos detalles y ofrece una opción general para un mayor control sobre los aspectos de dibujo del árbol. ^{[ 37 ]}

El menú de subárboles proporciona opciones para manipular el árbol, como intercambiar ramas, invertir el orden de los linajes, comprimir/expandir subárboles y mover la raíz del árbol. Los subárboles también se pueden mostrar en su propio explorador de árboles con todas las mismas características y opciones. ^{[ 38 ]} El menú de cálculo proporciona opciones para calcular un árbol condensado, un árbol de consenso o un árbol temporal con o sin reloj molecular. ^{[ 39 ]} El menú de archivos proporciona opciones para guardar, exportar, imprimir y salir. La topología del árbol se puede exportar a un archivo en formato de árbol MEGA, o para árboles temporales, exportar en un formato tabular con la información relevante utilizada al construir el árbol temporal. Otras opciones de exportación incluyen las calibraciones actuales del árbol temporal, el resumen del análisis, la lista de particiones y las distancias por pares. ^{[ 40 ]} El explorador de árboles también proporciona opciones para guardar la visualización actual del árbol en un formato de imagen o en el portapapeles en la opción de menú de imagen. Los formatos de imagen admitidos son BMP, PNG, PDF, SVG, TIFF y EMF. ^{[ 41 ]} Si el usuario optó por construir el árbol con replicación bootstrap, el explorador de árboles tendrá dos pestañas, una con el árbol original y otra con el árbol de consenso bootstrap.