Hispanopedia WikiLa espectroscopia de modulación microfluídica ( MMS ) es una técnica de espectroscopia infrarroja que se utiliza para caracterizar la estructura secundaria de las proteínas . La espectroscopia infrarroja (IR) es bien conocida para esta aplicación. [ 1 ] Sin embargo, la falta de automatización, repetibilidad y rango dinámico de detección en plataformas convencionales como FTIR han sido limitaciones importantes que se han abordado con el desarrollo de la espectroscopia de modulación microfluídica.
Técnicas analíticas de caracterización biofísica
La espectroscopia de dicroísmo circular (CD) es una técnica para la caracterización de la estructura secundaria. La CD es útil para el análisis de proteínas α-helicoidales debido a la intensa señal que proporcionan las estructuras α-helicoidales en la región de CD. La deconvolución de la estructura secundaria mediante espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) también se utiliza para técnicas de análisis multivariante, incluyendo la descomposición en valores singulares , mínimos cuadrados parciales, modelado suave independiente de analogía de clases y redes neuronales. [ 2 ]
La dicroísmo circular (CD), al igual que la espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) convencional, también presenta importantes inconvenientes. La medición debe realizarse a bajas concentraciones, generalmente a 0,5 mg/mL, pero incluso hasta 0,1 mg/mL, lo que puede afectar la fiabilidad de los datos. La presencia de algunos excipientes en el tampón de formulación también puede interferir con las mediciones. Tanto la CD como la FTIR convencional carecen de sensibilidad para la caracterización de proteínas biofarmacéuticas como las inmunoglobulinas IgG1 e IgG2 . [ 3 ] La espectroscopia de modulación microfluídica es una técnica automatizada que supera estos desafíos de la FTIR y la CD para su uso en la caracterización de productos biofarmacéuticos. [ 4 ]
Aplicaciones
Evaluación de la estructura de orden superior
La caracterización de las estructuras de orden superior de las proteínas se realiza de forma rutinaria durante el ciclo de vida del desarrollo de productos biológicos. [ 5 ] Dado que la función biológica está relacionada con la estructura, es importante establecer que el producto biológico se fabrica con la estructura esperada (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal se crea con la lámina β y la hélice α esperadas). También es importante demostrar que la estructura no se ve afectada significativamente por los cambios en la fabricación del principio activo o del producto farmacéutico que surgen durante el desarrollo del producto. La espectroscopia de modulación microfluídica, gracias a su sensibilidad y precisión, detecta cambios en la estructura de orden superior en la formulación y a la concentración de interés, sin necesidad de dilución ni deuteración. Esta técnica proporciona información sobre qué motivos estructurales de la molécula proteica están cambiando, lo que ofrece una mayor orientación al desarrollar moléculas y formulaciones proteicas estables.
Biosimilitud
El desarrollo de fármacos biosimilares es una aplicación importante para las comparaciones de estructuras de orden superior. En los estudios de similitud analítica, la estructura de orden superior del producto innovador se compara con la del biosimilar para establecer la similitud estructural. Los estudios de comparabilidad y biosimilitud suelen utilizar la espectroscopia de modulación microfluídica para evaluar las diferencias estructurales de los productos. Esta técnica revela diferencias conformacionales muy pequeñas entre distintas proteínas y proporciona información sobre dónde se producen dichas diferencias. Estas capacidades convierten a la espectroscopia de modulación microfluídica en una herramienta poderosa para el análisis y el desarrollo de biosimilares .
Agregación
La agregación de proteínas es el proceso por el cual las proteínas comienzan a unirse bajo diferentes condiciones y formulaciones. Para que las proteínas terapéuticas sean seguras y eficaces, es fundamental comprender bien sus comportamientos de plegamiento incorrecto y agregación. [ 6 ] Tanto el procesamiento previo como el posterior pueden causar agregación, un indicador común de inestabilidad proteica, lo que puede hacer que un producto terapéutico no sea apto para su comercialización.
La espectroscopia de modulación microfluídica puede medir cambios previamente indetectables en los atributos estructurales de las proteínas , cambios que son cruciales para la eficacia y la calidad de los fármacos. [ 7 ] Es una de las pocas técnicas que puede monitorear directamente la formación de agregados debido a su capacidad para medir estructuras de láminas beta intermoleculares.
Desarrollo de la formulación
Es fundamental comprender en detalle los mecanismos de agregación para controlar la estabilidad y garantizar un producto farmacéutico seguro y eficaz. Una de las principales motivaciones en la formulación es comprender estos mecanismos, lo cual se logra mediante análisis de alto rendimiento y una intensa recopilación de información.
Los científicos de formulación utilizan un conjunto básico de técnicas analíticas para cuantificar los parámetros de estabilidad coloidal, química y conformacional que definen la estabilidad de un biofármaco. Sin embargo, este conjunto de herramientas presenta deficiencias ampliamente reconocidas, en particular la incapacidad de medir la diferencia conformacional con alta reproducibilidad en formulaciones clínicamente representativas. Por las razones mencionadas anteriormente, la espectroscopia de modulación microfluídica proporciona la capacidad de muestra mediante el funcionamiento de placas de 96 pocillos y las capacidades técnicas necesarias para dilucidar la estabilidad coloidal y química, de las que carecen las técnicas existentes como la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), la espectrometría de masas y la electroforesis capilar .
Control de calidad (laboratorios que cumplen con las normas GMP/CFR)
Las pruebas de calidad eficaces actúan como salvaguarda de la calidad del producto, controlando los cambios críticos en la estructura de las sustancias farmacéuticas, los productos farmacéuticos, las materias primas o los excipientes. El aseguramiento de la calidad (AC) es un enfoque sistemático que establece un conjunto de directrices para todas las facetas del proceso de fabricación que podrían afectar la calidad del producto.
Los fármacos biológicos son moléculas complejas que presentan microheterogeneidad, es decir, pequeñas variaciones químicas como diferencias estructurales en los glicanos , desamidación , oxidación y glicación . Un análisis exhaustivo ayuda a establecer relaciones sólidas entre estructura y función que definen los límites del riesgo inaceptable. La identificación de todos los atributos críticos de calidad (ACQ) posibles es fundamental para un control de calidad eficaz. La espectroscopia de modulación microfluídica facilita la medición de los atributos de la estructura secundaria de los biofármacos en todas las etapas del proceso de fabricación. Esto permite establecer parámetros de calidad en etapas que no son posibles con las técnicas tradicionales.
Cuantificación
La estructura de las proteínas y su comportamiento en solución se ven afectados por la concentración. La cuantificación precisa de la concentración permite un mejor análisis y comparación de los resultados entre diferentes proteínas y formulaciones. No existe un método analítico común para la cuantificación debido a las limitaciones de las técnicas tradicionales (por ejemplo, el rango dinámico limitado de las herramientas espectroscópicas tradicionales (como la resolución limitada y la linealidad del detector)). Dado que la absorbancia de la muestra se mide dentro de un rango dinámico muy limitado, esto obliga a los científicos a realizar ajustes adicionales, ya sea en la concentración de la muestra o en la longitud del paso óptico, para lograr una cuantificación precisa de las proteínas.
La espectroscopia de modulación microfluídica permite la cuantificación directa de proteínas sin necesidad de marcadores en un amplio rango de concentraciones y es más selectiva que la instrumentación espectroscópica tradicional, con menor susceptibilidad a las interferencias. La espectroscopia de modulación microfluídica aumenta la sensibilidad y reduce significativamente los errores comunes en la espectroscopia convencional.
Componentes
La espectroscopia de modulación microfluídica emplea un láser de cascada cuántica de infrarrojo medio sintonizable para generar un haz óptico 1000 veces más brillante que los utilizados en la espectroscopia FTIR convencional . Esto permite medir muestras con concentraciones considerablemente mayores que las que se pueden medir con otras técnicas, y utilizar detectores más sencillos sin necesidad de refrigeración con nitrógeno. El láser funciona en modo de onda continua para generar un haz de muy alta resolución (< 0,001 cm⁻¹ de ancho de línea), con bajo nivel de ruido y mínima luz dispersa, que se enfoca a través de una celda de transmisión microfluídica con una trayectoria óptica corta (25 μm) sobre un detector de mercurio, cadmio y telurio (MCT) refrigerado termoeléctricamente. Esta configuración óptica proporciona mediciones de alta sensibilidad en un rango de concentración de 0,1 a 200 mg/mL para la caracterización estructural y hasta 0,01 mg/mL para la cuantificación de proteínas, lo que confiere a la espectroscopia de modulación microfluídica un rango dinámico mucho más amplio que otras técnicas de caracterización de proteínas.
En la espectroscopia de modulación microfluídica, la solución de muestra (proteína en tampón) y una corriente de referencia de tampón correspondiente se introducen en la celda de transmisión bajo flujo continuo y luego se modulan rápidamente (1-10 Hz) a lo largo de la trayectoria del haz láser para producir escaneos diferenciales de la banda Amida I prácticamente libres de deriva y con compensación de fondo. El sistema óptico completo está sellado y purgado con aire seco para minimizar cualquier interferencia del vapor de agua atmosférico, que absorbe en el rango de número de onda de 2000 a 1300 cm⁻¹ y, por lo tanto, puede comprometer el uso de la espectroscopia IR para la caracterización de proteínas. La tecnología avanzada de procesamiento de señales es el tercer elemento clave del instrumento y convierte los espectros brutos en datos de contribución fraccionaria para motivos específicos de estructura secundaria, proporcionando una huella estructural de la proteína.
Referencias
- ↑ W. Wang y CJ Roberts, Agregación de proteínas terapéuticas (Wiley, 2010), A. Elliott y EJ Ambrose, Nature 165, 921–922 (1950), H. Susi y DM Byler, Methods Enzymol. 130, 290–311 (1986), WK Surewicz y HH Mantsch, Biochim. Biophys. Acta 952, 115–130 (1988), A. Dong, P. Huang y WS Caughey, Biochemistry 29 (13) 3303–3308 (1990), SJ Prestrelski, AL Williams Jr. y MN Liebman, Proteins Structure Function and Bioinformatics 14 (4) 440–450 (1992), WK Surewicz, HH Mantsch y D. Chapman, Biochemistry 32 (2) 389–394 (1993), JLR Arrondo, et al., Prog. Biophys. Mol. Biol. 59 (1) 23–56 (1993)
- ↑ S. Vonhoff, J. Condliffe, H. Schiffter J Pharm Biomed Anal, 51 (1) (2010), pp. 39-45
- ↑ J. Wen, et al., J. Pharm. Sci. 109 (1) 247– 253 (2020)
- ↑ E. Ma, L. Wang y B. Kendrick, Spectroscopy 33 (7) 46–52 (2018)
- ↑ Brent S. Kendrick, John P. Gabrielson, Caroline Warly Solsberg, Eugene Ma, Libo Wang J of Pharmaceutical Sciences, 109 (1), 2020, 933-936
- ↑ Roberts, CJ. Tendencias en Biotecnología. 2014; 32: 372–380
- ↑ Ma E, Wang L y Kendrick B. Spectroscopy 2018; 33: 46–52
- Espectroscopia infrarroja
- Microfluídica