Aislamiento (microbiología)

Los técnicos de laboratorio inoculan la muestra en determinadas placas de agar sólido mediante el método de siembra por estrías o en un medio de cultivo líquido , según el objetivo del aislamiento:

• Si se desea aislar solo un grupo particular de bacterias, como el estreptococo del grupo A de un hisopado faríngeo, se puede usar un medio selectivo que suprima el crecimiento de las bacterias concomitantes esperadas en la mezcla (por los antibióticos presentes en el agar), de modo que solo los estreptococos sean "seleccionados", es decir, que se destaquen visiblemente. ^{[ 4 ]} Para aislar hongos, se puede usar agar Sabouraud . Alternativamente, las condiciones letales para los estreptococos y las bacterias gramnegativas, como las altas concentraciones de sal en el agar sal manitol, favorecen la supervivencia de cualquier estafilococo presente en una muestra de bacterias intestinales, y el rojo fenol en el agar actúa como un indicador de pH que muestra si las bacterias son capaces de fermentar el manitol excretando ácido en el medio. En otros agares se agregan sustancias para explotar la capacidad de un organismo de producir un pigmento visible (por ejemplo, el medio granada para el estreptococo del grupo B ) que cambia el color de la colonia bacteriana , o para disolver el agar sangre por hemólisis para que puedan ser detectados más fácilmente. Algunas bacterias, como las especies de Legionella, requieren nutrientes específicos o la unión de toxinas, como en el caso del carbón vegetal , para crecer; por lo tanto, deben utilizarse medios de cultivo como el agar con extracto de levadura y carbón vegetal tamponado .
• Si se desea aislar la mayor cantidad posible de cepas, es necesario inocular diferentes medios de cultivo, incluyendo medios enriquecidos como agar sangre y agar chocolate , así como medios de cultivo anaeróbicos como el caldo de tioglicolato . Para cuantificar el crecimiento, las bacterias se pueden suspender en agar fundido antes de que se solidifique y luego verter en placas de Petri , mediante el método de siembra en placa, utilizado en microbiología ambiental y alimentaria (por ejemplo, en análisis de productos lácteos) para determinar el recuento de bacterias aerobias en placa.

Después de inocular la muestra en el medio de cultivo elegido, se incuba bajo las condiciones atmosféricas apropiadas, como condiciones aerobias, anaerobias o microaerofílicas o con dióxido de carbono añadido (5%), a diferentes temperaturas, por ejemplo 37  °C en una incubadora o en un refrigerador para enriquecimiento en frío, bajo la luz apropiada, por ejemplo, estrictamente sin luz envuelto en papel o en una botella oscura para micobacterias escotocromógenas , y durante diferentes períodos de tiempo, porque las diferentes bacterias crecen a una velocidad diferente, que varía desde horas ( Escherichia coli ) hasta semanas (por ejemplo, micobacterias ).

A intervalos regulares, los técnicos de laboratorio y los microbiólogos inspeccionan los medios de cultivo en busca de signos de crecimiento visible y los registran. La inspección debe realizarse en condiciones que favorezcan la supervivencia del aislado, por ejemplo, en una cámara anaeróbica para bacterias anaerobias, y en condiciones que no representen un riesgo de infección para la persona que observa las placas, ya que podría contagiarse con un microorganismo particularmente infeccioso, por ejemplo, bajo una cabina de seguridad biológica para Yersinia pestis (peste) o Bacillus anthracis (ántrax).

Cuando las bacterias han crecido visiblemente, a menudo aún se encuentran mezcladas. La identificación de un microbio depende del aislamiento de una colonia individual , ya que las pruebas bioquímicas para determinar sus diferentes características fisiológicas requieren un cultivo puro . Para realizar un subcultivo , se sigue una técnica aséptica en microbiología : se toma una sola colonia de la superficie del agar con un asa y se siembra en estrías en los cuatro cuadrantes de una placa de agar, o en toda la placa si la colonia era única y no parecía estar mezclada.

La tinción de Gram permite visualizar la composición de la pared celular de las bacterias según el color que adquieren tras una serie de pasos de tinción y decoloración. ^{[ 5 ]} Este proceso de tinción permite identificar bacterias gramnegativas y grampositivas . Las bacterias gramnegativas se tiñen de rosa debido a la fina capa de peptidoglicano. Si una bacteria se tiñe de púrpura, debido a la gruesa capa de peptidoglicano, se trata de una bacteria grampositiva. ^{[ 5 ]}

En microbiología clínica se utilizan numerosas técnicas de tinción para organismos específicos (tinción de bacilos ácido-resistentes para micobacterias). Se han desarrollado técnicas de tinción inmunológica, como la inmunofluorescencia directa , para patógenos de importancia médica que crecen lentamente ( tinción de auramina-rodamina para micobacterias ) o que son difíciles de cultivar (como la especie Legionella pneumophila ) y en los que el resultado de la prueba alteraría el tratamiento estándar y la terapia empírica .

Las pruebas bioquímicas de bacterias implican un conjunto de agares en viales para separar las bacterias móviles de las inmóviles . En 1970 se desarrolló una versión miniaturizada, llamada índice de perfil analítico .

La identificación exitosa mediante, por ejemplo, la secuenciación del genoma y la genómica, depende de cultivos puros.