Microtécnica

Las preparaciones completas se utilizan generalmente cuando los observadores necesitan usar un organismo completo o realizar alguna investigación detallada sobre la estructura de un órgano específico. ^{[ 7 ]} Este método requiere objetos de los que se pueda eliminar la humedad, como semillas y microfósiles. ^{[ 2 ]}

Según sus diferentes propósitos, las preparaciones completas se pueden dividir en tres categorías: preparaciones completas temporales, preparaciones completas semipermanentes y preparaciones completas permanentes. Las preparaciones completas temporales se utilizan generalmente para actividades de enseñanza en clase. ^{[ 8 ]} Las preparaciones completas semipermanentes se preparan para un uso prolongado, que no supera los catorce días. En esta preparación, se utiliza bálsamo de Canadá para sellar los especímenes, y este método se utiliza para observar algas unicelulares y coloniales, esporas de hongos, protonemas de musgos y protalos. La tercera opción es la preparación completa permanente. ^{[ 8 ]} Generalmente se utilizan dos métodos: el método de higrobutol y el método de glicerina - xilol . ^{[ 9 ]}

El frotis es una forma sencilla de preparar cortes. Este método se utiliza en muchos laboratorios. ^{[ 10 ]} Los frotis se pueden emplear al preparar muestras para portaobjetos extendiendo materiales líquidos o semilíquidos, o tejidos y células sueltas de animales y plantas, de manera uniforme sobre el portaobjetos. ^{[ 10 ]} Los pasos y requisitos para la aplicación del método de frotis son los siguientes: primero, extender. Cuando se extiende el material sólido, este debe colocarse sobre el portaobjetos y limpiarse, luego usar una cuchilla para presionar el material en un lado. ^{[ 11 ]} Las células deben presionarse y distribuirse uniformemente sobre el portaobjetos en una capa delgada, como la antera extendida. ^{[ 10 ]}

La compresión es un método en el que los objetos se aplastan con fuerza. Este método es adecuado para preparar tejidos tanto transparentes como delicados. ^{[ 12 ]} Al preparar portaobjetos mediante compresión, se espera que las muestras sean delgadas y transparentes para que los objetos puedan observarse claramente bajo el microscopio. ^{[ 12 ]}

Esta técnica consiste en colocar el material sobre el portaobjetos y retirarlo con un bisturí o una aguja de disección, para luego añadir una gota de solución colorante. ^{[ 2 ]} Tras estos pasos, se coloca un segundo portaobjetos sobre el primero y se aplica presión uniforme para romper el material y dispersar las células. ^{[ 12 ]} Además, existe otra forma de preparar los portaobjetos. Las muestras también pueden extruirse entre el cubreobjetos y el portaobjetos con la misma presión. ^{[ 12 ]}

Las secciones, conocidas como cortes delgados, deben ser probadas en todos los estudios de estructuras celulares. ^{[ 13 ]} Esta técnica puede utilizarse para la preparación de tejido de animales y plantas. ^{[ 14 ]} Para su uso bajo microscopía óptica, el grosor del material debe estar entre más de 2 y 25 micrómetros. Al observar bajo microscopía electrónica, las secciones deben ser de 20 a 30 nanómetros. ^{[ 2 ]} El micrótomo puede utilizarse para seccionar cortes suficientemente delgados. Si los objetos no pueden satisfacer el requisito de grosor, los materiales deben deshidratarse con alcohol antes de la sección. ^{[ 12 ]} Tres métodos de seccionamiento comúnmente utilizados son la técnica de sección a mano alzada, el método de parafina y el método de celoidina.

El examen microscópico directo es una forma sencilla de observar microobjetos. Además, este método es útil para observar si el moho crece en la superficie de las muestras. Este puede ser un paso inicial del experimento microscópico. ^{[ 17 ]}

El corte a mano alzada es un método para hacer rebanadas finas de materiales experimentales frescos o fijados con una cuchilla manual . ^{[ 18 ]} El corte a mano alzada se refiere al método de cortar directamente materiales frescos o fijados (generalmente plantas con un bajo grado de lignificación) en rebanadas finas sin instrumentos especiales ni reactivos químicos especiales. ^{[ 16 ]}

La técnica de aclaramiento proporciona portaobjetos translúcidos mediante la eliminación de parte del contenido citoplasmático y la posterior aplicación de reactivos de alto índice de refracción para procesar los tejidos. ^{[ 2 ]} Este método es adecuado para preparar portaobjetos de montaje completo. El aclaramiento es un procedimiento que utiliza reactivos de aclaramiento para eliminar el alcohol y hacer que el tejido sea translúcido. ^{[ 19 ]} El xileno es el agente de aclaramiento más popular. ^{[ 20 ] [ 21 ]}

La maceración de tejidos es el proceso de separar las células constituyentes de los tejidos. Este método permite a los observadores estudiar la célula completa con detalle tridimensional. ^{[ 8 ]} El método de maceración química consiste en utilizar productos químicos para procesar órganos o partes de ellos, ablandando el tejido y disolviendo las células para poder identificar las diferentes células. ^{[ 8 ]}

La técnica de inclusión es una etapa intermedia en el proceso de seccionamiento. ^{[ 13 ]} Al preparar las muestras, es difícil obtener cortes uniformes debido a la blandura del tejido. ^{[ 22 ]} Por lo tanto, es necesario sumergir el tejido en una sustancia específica para endurecerlo y facilitar el corte. Este proceso se denomina inclusión. ^{[ 22 ]} La sustancia utilizada para incluir el tejido es el medio de inclusión, cuya elección depende del tipo de microscopio, del tipo de micrótomo y del tipo de tejido. ^{[ 23 ]} La parafina, cuyo punto de fusión oscila entre 56 y 62  °C, se utiliza comúnmente para la inclusión. ^{[ 22 ]}

Dado que pocos tejidos vegetales tienen color, la escasa diferencia cromática entre ellos dificulta la diferenciación de la estructura botánica. ^{[ 24 ]} El material se tiñe generalmente antes de su instalación. Este proceso se denomina tinción y se utiliza para preparar especímenes botánicos de manera que sea posible distinguir una parte de la muestra de otra en términos de color. ^{[ 2 ]} Se pueden utilizar colorantes ácidos al teñir portaobjetos microscópicos; por ejemplo, se utilizan para teñir núcleos y otros componentes celulares que se tiñen con colorantes alcalinos. ^{[ 2 ]} También existen máquinas de tinción que permiten teñir el tejido automáticamente. ^{[ 25 ]}

La técnica de celoidina consiste en la inclusión de una muestra en celoidina. ^{[ 32 ]} Este método se puede utilizar para incluir objetos grandes y duros. ^{[ 33 ]} La celoidina es una fibra digestiva, inflamable y soluble en acetona, aceite de clavo y la mezcla de alcohol anhidro y éter. ^{[ 34 ]} La celoidina se convierte en un líquido turbio de emulsión blanca al entrar en contacto con el agua, por lo que es necesario utilizar un recipiente seco para contenerla. ^{[ 33 ]}

El método de corte con celoidina consiste en fijar y deshidratar el tejido, para luego tratarlo con una mezcla de alcohol-éter anhidro. Posteriormente, se impregna, se incluye y se corta el tejido con celoidina. ^{[ 35 ]} Además, este método permite cortar tejidos grandes y tiene la ventaja de que el calor evita que los tejidos se contraigan. Sin embargo, esta técnica presenta algunas limitaciones. Por ejemplo, los cortes no pueden ser muy finos (más de 20 micras) y la impregnación con celoidina requiere mucho tiempo. ^{[ 36 ]}

La técnica de congelación es el método de seccionamiento más utilizado. ^{[ 37 ]} Este método permite preservar adecuadamente la actividad inmunitaria de diversos antígenos . Se puede congelar tanto tejido fresco como tejido fijado. Además, también se utiliza para congelar secciones de tejidos vegetales, ya sean frescos o fijados. ^{[ 38 ]}

Durante el proceso de congelación, el agua en los tejidos tiende a formar cristales de hielo, lo que suele afectar la localización de antígenos. ^{[ 37 ]} Generalmente se cree que cuando los cristales de hielo son pequeños, el efecto es menor, y cuando son grandes, el daño a la estructura del tejido es mayor. Este fenómeno es más probable que ocurra en tejidos con mayor contenido de humedad. ^{[ 39 ]} El tamaño de un cristal de hielo es directamente proporcional a su tasa de crecimiento e inversamente proporcional a la tasa de nucleación (tasa de formación); es decir, cuanto mayor sea la cantidad de cristales de hielo formados, menor será su tamaño y mayor será el impacto en la estructura. ^{[ 40 ]} Por lo tanto, se debe minimizar la cantidad de cristales de hielo. El método de congelación permite seccionar tejidos rápidamente y realizar biopsias sin utilizar reactivos. Este procedimiento debe realizarse con rapidez en caso de que se formen cristales de hielo. ^{[ 39 ]}