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Biosensores de microARN

Figura que ilustra el flujo de trabajo para la detección de miRNA. Los miRNA se pueden detectar con biosensores complejos, como biosensores electroquímicos y ópticos. Los biosen...

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Figura que ilustra el flujo de trabajo para la detección de miRNA. Los miRNA se pueden detectar con biosensores complejos, como biosensores electroquímicos y ópticos. Los biosensores de miRNA utilizan nanomateriales, elementos de reconocimiento y elementos de amplificación para una detección sensible y específica de los miRNA.

Los biosensores de microARN (miRNA) son dispositivos analíticos que implican interacciones entre las hebras de miRNA objetivo y un elemento de reconocimiento en una plataforma de detección para producir señales que pueden medirse para indicar los niveles o la presencia del miRNA objetivo. Las investigaciones sobre biosensores de miRNA muestran tiempos de lectura más cortos, mayor sensibilidad y especificidad en la detección de miRNA y menores costos de fabricación que los métodos convencionales de detección de miRNA. [ 1 ]

Los miRNA son una categoría de ARN pequeños no codificantes con una longitud de entre 18 y 25 pares de bases. [ 1 ] Los miRNA regulan procesos celulares como la regulación génica postranscripcional y son abundantes en fluidos corporales como la saliva, la orina y fluidos circulatorios como la sangre. Además, los miRNA se encuentran en animales y plantas y tienen funciones reguladoras que afectan los mecanismos celulares. Los miRNA están altamente asociados con enfermedades como el cáncer y las enfermedades cardiovasculares . En el cáncer, los miRNA tienen funciones oncogénicas o supresoras de tumores y son biomarcadores prometedores para el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad. [ 1 ] Existen muchas técnicas en entornos clínicos y de investigación para analizar biomarcadores de miRNA. Sin embargo, las limitaciones inherentes a los métodos actuales, como el alto costo, el tiempo y los requisitos de capacitación del personal, y la baja sensibilidad y especificidad de detección, crean la necesidad de mejorar los métodos de detección de miRNA. [ 1 ]

Fondo

Los microARN (miRNA) están asociados con procesos fisiológicos y patológicos; por lo tanto, su medición es necesaria en campos como la salud humana, la agricultura y los análisis ambientales. A continuación, se presentan algunos aspectos clave que justifican la necesidad de detectar los miRNA:

  • Biomarcadores potenciales: Los miRNAs presentan una expresión específica en enfermedades como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y las enfermedades autoinmunes, lo que puede ser beneficioso para la detección temprana, el pronóstico y el seguimiento de la respuesta a los tratamientos. [ 2 ] Además, dado que los miRNAs se encuentran en fluidos corporales como la orina, la saliva y la sangre, su detección es menos invasiva que métodos como las biopsias . Esto resulta más cómodo para los pacientes y puede facilitar un seguimiento más frecuente de su enfermedad. [ 3 ]
  • Mecanismos moleculares: Dado que los miRNAs desempeñan funciones reguladoras en la expresión génica y las vías de señalización , su estudio puede revelar la etiología de las enfermedades y su modulación puede ofrecer opciones terapéuticas. [ 4 ] [ 5 ]
  • Medicina personalizada : Debido a que la expresión específica de los microARN ofrece una vía prometedora para mejorar la medicina personalizada , proporcionan una comprensión más profunda del riesgo individual de enfermedad, la respuesta al tratamiento y el pronóstico, lo que ayuda a los médicos a tomar decisiones clínicas mejor fundamentadas. [ 6 ]

Historia de la tecnología de detección de miRNA

Métodos de detección temprana y actual

El primer miRNA (lin-4) fue detectado por Victor Ambros en Caenorhabditis elegans en 1993. [ 7 ] El primer método de detección fue la transferencia Northern (1977), que tenía baja sensibilidad. Posteriormente, se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) (1990), que tenía alta sensibilidad de detección. [ 8 ] [ 9 ]

  • Northern Blotting: El Northern blotting consiste en hibridar sondas de miRNA (secuencias cortas de ácido nucleico ) con miRNAs, seguidas de su separación en un gel y transferencia a una membrana. Las sondas se marcan con isótopos radiactivos (lo que plantea problemas de seguridad y medioambientales), enzimas o marcadores fluorescentes. La cantidad de ARN presente se infiere a partir de la intensidad de la señal de la sonda. Si bien el Northern Blotting es altamente específico y útil para validar métodos de alto rendimiento como la secuenciación de ARN (RNA-seq), requiere un gran volumen de muestra, consume mucho tiempo y carece de precisión en el análisis de cuantificación. [ 10 ] [ 11 ]
  • Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR en tiempo real): Este método comienza con la conversión de miRNA en cDNA mediante enzimas transcriptasa inversa . El cDNA se amplifica posteriormente utilizando cebadores específicos de secuencia, un proceso que se monitoriza mediante colorantes o sondas fluorescentes. La RT-PCR en tiempo real destaca por su sensibilidad y especificidad. Sin embargo, presenta desafíos como la necesidad de estandarización, complejidades técnicas (p. ej., diseño de cebadores, preparación de muestras), procesos que requieren mucho tiempo y altos costos. [ 12 ] [ 13 ]

Métodos de alto rendimiento:

  • Microarrays (1990) : Los microarrays permiten la detección de miles de miRNAs en un solo experimento. Consisten en una superficie sólida a la que se unen secuencias complementarias de miRNA. La introducción de miRNAs permite que se unan a estas sondas, y la cantidad de miRNA se mide mediante la intensidad de fluorescencia. Los microarrays son rentables en comparación con la RT-PCR en tiempo real y la NGS, pero tienen limitaciones para detectar bajas cantidades de miRNAs y distinguir entre miRNAs con secuencias similares. [ 14 ] [ 15 ]
  • Secuenciación de Nueva Generación (NGS) (2005) : La NGS comienza con la extracción de ARN y la transcripción inversa a ADNc, seguida de la ligación de adaptadores y la amplificación. El ADNc se secuencia en una plataforma NGS, generando millones de lecturas cortas. Bioinformáticos expertos y herramientas sofisticadas deben alinear y analizar los datos y mapear las lecturas a secuencias de miRNA de referencia para el descubrimiento e identificación de miRNA. La NGS ofrece alta sensibilidad y especificidad para detectar miRNA en bajas cantidades e identificar miRNA que difieren en un solo nucleótido. [ 16 ] [ 17 ]

Principios de los biosensores de microARN

Los biosensores de miRNA se componen de tres elementos esenciales:

  • Elemento de reconocimiento biológico: pueden detectar moléculas objetivo específicas y existen diferentes tipos, incluyendo anticuerpos, antígenos, ADN/ARN, aptámeros, enzimas y MIP (polímeros con impronta molecular). [ 18 ] [ 19 ]
  • Transductor : tras el reconocimiento, el transductor es un elemento necesario para convertir los cambios en el elemento de reconocimiento en una señal medible. Según el tipo de señal que producen, se clasifican en transductores electroquímicos, ópticos y mecánicos. [ 20 ] 
  • Procesador de señales : elementos computacionales que amplifican y procesan las señales producidas por los transductores y que pueden representarse mediante valores numéricos y lecturas digitales. [ 21 ] [ 22 ]

Especificidad en la detección de miRNA

El término "especificidad" en el contexto de los biosensores de miRNA se refiere a la capacidad del biosensor para identificar un miRNA específico dentro de una muestra que contiene diversos componentes y miRNAs con secuencias similares. El desafío para lograr esta especificidad radica en el pequeño tamaño de los miRNAs, que pueden diferir entre sí por tan solo un nucleótido. Por consiguiente, es fundamental diseñar biosensores capaces de reconocer con precisión el miRNA objetivo. [ 23 ]

Sensibilidad en la detección de miRNA

La sensibilidad en los biosensores de miRNA se refiere a su capacidad para detectar miRNAs objetivo en bajas concentraciones dentro de las muestras. Dado que los miRNAs se encuentran típicamente en pequeñas cantidades, los biosensores están diseñados para identificar concentraciones tan bajas como femtomolares (10⁻¹⁵) o attomolares (10⁻¹⁸). Lograr una sensibilidad tan alta implica mejoras en los elementos de reconocimiento, la amplificación y las técnicas de procesamiento de señales. El límite de detección (LoD) se utiliza para determinar el valor concreto de la sensibilidad en los biosensores, que indica la concentración más baja de miRNA que se puede separar de la señal de fondo (cero) con un nivel de confianza específico. [ 24 ]

El rango dinámico en los biosensores de miRNA se refiere a las concentraciones en las que el biosensor puede detectar con precisión los miRNA objetivo, extendiéndose desde el límite de detección más bajo hasta la concentración máxima que se puede medir sin necesidad de diluir la muestra. [ 25 ] [ 26 ]

Tipos de biosensores de microARN

biosensores electroquímicos

Mecanismo general de un biosensor electroquímico de miRNA basado en marcadores.

Los biosensores electroquímicos presentan ventajas significativas para la detección de miRNA en comparación con los métodos convencionales de análisis de miRNA. El uso de componentes electrónicos sencillos reduce los costos de producción y facilita su uso en configuraciones de sistemas portátiles. Esto permite un mayor alcance de uso, incluyendo aplicaciones ambientales, clínicas y de análisis de alimentos. [ 27 ]

La detección mediante biosensores electroquímicos de miRNA se basa en la medición de los cambios en la propiedad del electrodo o la señal redox del compuesto electroactivo durante la transducción de especies reporteras electroquímicamente activas y la hibridación entre el miRNA objetivo y la sonda complementaria. Se pueden utilizar diversos materiales para el elemento de transducción, como plata, oro, grafito o nanopartículas de estos materiales. La detección de cambios en las propiedades electroquímicas permite el análisis en tiempo real y la obtención de datos cinéticos, una ventaja de la que carecen otros métodos de biosensores, como los biosensores ópticos. La contaminación lumínica no supone una limitación para los biosensores electroquímicos de miRNA. Sin embargo, pueden ser necesarias técnicas de amplificación, como la amplificación por círculo rodante (RCA), cuando las concentraciones de miRNA son insuficientes para generar una señal eléctrica. [ 28 ]

1. Biosensores electroquímicos voltamétricos y amperométricos

Los biosensores electroquímicos de miRNA pueden diseñarse para realizar mediciones voltamétricas o amperométricas . Tras la hibridación del miRNA diana con su secuencia de sonda complementaria, los biosensores voltamétricos de miRNA detectan el cambio de corriente en función de un aumento o disminución controlada del potencial eléctrico en la plataforma de detección. Los biosensores amperométricos detectan el cambio de corriente eléctrica a un potencial eléctrico positivo fijo. [ 1 ] Los avances recientes en biosensores voltamétricos y amperométricos de miRNA pueden clasificarse como biosensores con o sin marcadores, según si se utilizan o no marcadores electroactivos en el miRNA diana, como sugiere la nomenclatura. [ 1 ]

  • Biosensores de miRNA voltamétricos y amperométricos sin marcadores (detección directa)
Publicados por primera vez en 2009, los biosensores electroquímicos de miRNA sin marcaje (detección directa) funcionan sin marcar el miRNA objetivo con etiquetas de nanopartículas electrocatalíticas o indicadores de hibridación. [ 29 ] Los biosensores de miRNA sin marcaje se basaron inicialmente en la detección de ADN a través de mediciones de electrooxidación de guanina, con un límite de detección inferior de 5 nM de miRNA. Desde entonces, se han desarrollado materiales de electrodo para aumentar la sensibilidad de detección a menos de 1 pM, como con grafeno y electrodos modificados con líquidos iónicos. [ 30 ] [ 31 ] Por ejemplo, Wu et al. (2013) aumentaron la conductividad de la superficie del electrodo de un biosensor amperométrico con una multicapa que consistía en Nafion , tionina y nanopartículas de paladio, que inmovilizó el miRNA objetivo en la superficie del electrodo para un límite de detección inferior de 1,87 pM. [ 32 ] Los biosensores de miRNA sin marcaje detectan señales antes y después de la hibridación de bases de ácidos nucleicos electroactivas. [ 33 ] Por ejemplo, se han integrado nanopartículas de oro cargadas con doxorrubicina (AuNPs) con una sonda de horquilla de doble bucle que se hibrida con el miRNA objetivo para formar heterodúplex, en los que las nucleasas específicas de dúplex hidrolizan el ADN en las estructuras heterodúplex para liberar las hebras de miRNA objetivo para su amplificación en un sistema de amplificación de señal. El límite de detección en dicho sistema es de 0,17 pM. [ 34 ]
  • Biosensores de miRNA basados ​​en marcadores voltamétricos y amperométricos (detección indirecta)
Los biosensores electroquímicos de miRNA basados ​​en marcadores (detección indirecta) requieren el marcaje electrocatalítico o con moléculas o nanopartículas redox activas del miRNA diana o de sondas de captura complementarias para su detección. Generalmente, los métodos basados ​​en marcadores ofrecen una sensibilidad de detección de miRNA significativamente mayor que los métodos sin marcadores, alcanzando una sensibilidad del orden de fM a aM. [ 35 ] [ 36 ]
Un ejemplo son los biosensores de miRNA basados ​​en superredes de AuNp que utilizan el colorante catiónico de molécula pequeña azul de toluidina para detectar miRNA-21. El azul de toluidina actúa como un marcador intercalante de miRNA mediante interacción electrostática con los grupos fosfato de la cadena principal cargados negativamente. En el biosensor, el azul de toluidina es un indicador redox que mide la corriente del pico de oxidación del azul de toluidina e indica la hibridación del miRNA. Los niveles de LoD alcanzaron 78 aM. [ 37 ]

2. Biosensores electroquímicos de miRNA basados ​​en amplificación (enzimas)

Se han desarrollado estrategias de detección o amplificación electroquímica para biosensores de miRNA utilizando métodos enzimáticos. La amplificación de miRNA suele ser un componente necesario para la detección mediante biosensores, ya que las concentraciones de miRNA se encuentran en baja abundancia, y la amplificación de las cadenas de miRNA objetivo aumentará la sensibilidad de la detección. [ 38 ] Además, las propiedades inherentes del miRNA incluyen una longitud de cadena corta y una alta homología de secuencia, lo que representa un desafío para la sensibilidad y especificidad de la detección. [ 1 ]

Varios métodos, como las enzimas nucleasas específicas de dúplex y la extensión de la polimerasa, pueden amplificar los objetivos de miRNA para alcanzar LoD en el rango de fM. [ 1 ] Las técnicas de amplificación isotérmica son técnicas de amplificación de miRNA basadas en enzimas ampliamente utilizadas, dadas las ventajas de reducción de costos y tiempo asociadas con la facilidad de uso en comparación con los métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los métodos isotérmicos amplifican ácidos nucleicos a una temperatura constante, lo que elimina el requisito de ciclo térmico utilizado en PCR y no requiere enzimas específicas para sitios de reconocimiento espacial en el miRNA objetivo. [ 1 ] Una técnica isotérmica comúnmente utilizada para la detección de miRNA es la amplificación en círculo rodante (RCA). En la RCA de objetivos de miRNA, el miRNA se une a una plantilla de ADN circular complementaria, que se amplifica de forma continua y exponencial a través de la síntesis de ADN monocatenario largo. [ 1 ] La investigación con biosensores electroquímicos de electrodo de oro ha demostrado que la RCA iniciada en el electrodo ha proporcionado niveles de LoD de 50 aM. [ 39 ] La naturaleza isotérmica y la facilidad de uso de RCA permiten su uso en entornos de diagnóstico clínico y laboratorios con recursos limitados, así como en dispositivos biosensores de punto de atención. [ 1 ]

Biosensores ópticos de miRNA

Tras la hibridación del miRNA diana marcado con una sonda de ácido nucleico y un reportero ópticamente activo, los biosensores ópticos basados ​​en marcadores transducen la señal óptica de absorbancia o fluorescencia en datos cuantificables. Los reporteros pueden ser puntos cuánticos o marcadores de colorante. [ 1 ] Por otro lado, los biosensores ópticos de miRNA sin marcadores detectan cambios en el índice de refracción (IR) en el elemento de reconocimiento, causados ​​por la unión del miRNA diana a su biorreceptor. El campo electromagnético sondea los cambios de IR, caracterizados como una onda evanescente . Los campos electromagnéticos se generan mediante modos ópticos guiados o resonantes que viajan en el elemento transductor. [ 40 ] Además, los biosensores ópticos de miRNA sin marcadores son insensibles a las moléculas de ARN o ADN no unidas o de fondo, ya que la detección óptica se limita a la superficie de reconocimiento del sensor. Esto es beneficioso para la detección de miRNA en pequeños volúmenes y representa una ventaja sobre otros biosensores de miRNA basados ​​en marcadores, ya que la detección de la señal se basa en la medición del número total de miRNA en la muestra. [ 40 ]

  • Biosensores ópticos de miRNA basados ​​en resonancia de plasmones superficiales
Los biosensores de miRNA basados ​​en resonancia de plasmones superficiales (SPR) son un método sin marcadores que detecta cambios en el índice de refracción (IR) después de que el miRNA objetivo se une a sus sondas y forma un complejo. La detección implica la propagación de una onda de plasmón superficial (SPW) a través de la capa superficial de la interfaz metal- dieléctrica del biosensor en una configuración de Kretschmann . [ 40 ] La SPW decae exponencialmente, y los cambios en la constante de propagación de la SPW se miden ya que la constante es sensible a los cambios en el IR. [ 41 ] Un ejemplo práctico de un biosensor de miRNA basado en SPR con marcadores es la detección de miR-21 con un límite de detección (LoD) de 1 fM. El biosensor utilizó nanopartículas de oro-óxido de grafeno integradas con el miRNA objetivo intercalado entre dos sondas de ADN para amplificar la señal SPR y tener hibridación secundaria a través de sondas reporteras de miR-21. [ 42 ]

Biosensores electromecánicos

Los biosensores electromecánicos representan una integración de las disciplinas de ingeniería eléctrica y mecánica, empleando una estrategia de detección que se basa en la hibridación de miRNAs a sondas específicas ancladas en la superficie del sensor. Las alteraciones subsiguientes en parámetros como la tensión o la masa se transducen en señales eléctricas. Una implementación notable involucra la microscopía de fuerza atómica (AFM), que ha identificado con éxito has-mir-194 y has-mir-205 en muestras relacionadas con cáncer de colon y vejiga. [ 43 ] El mecanismo subyacente de este enfoque es la capacidad de la AFM para delimitar las variaciones en la rigidez a través de la superficie de oro del biosensor, facilitando la detección de eventos de hibridación de miRNA. Otro componente fundamental en los biosensores electromecánicos es el sensor de voladizo piezoeléctrico recubierto de oro , que es experto en reconocer miRNA hibridados. [ 44 ] Aunque los biosensores electromecánicos son altamente sensibles a los miRNAs, es difícil medirlos en muestras con altas cantidades de diferentes moléculas. [ 1 ]

Nanomateriales utilizados en biosensores de miRNA

Los nanomateriales se utilizan por sus características únicas para facilitar la detección de miRNAs. Aquí, analizamos algunas características de los nanomateriales utilizados en biosensores de miRNA. [ 35 ]

  • Nanopartículas de oro (AuNPs): Las AuNPs mejoran las señales de detección de miRNA y facilitan la conjugación estable de elementos de reconocimiento en los miRNAs. [ 45 ] Las AuNPs poseen excelentes propiedades catalíticas, conductividad, alta área superficial y energía interfacial, y pueden modificarse con moléculas como agregados de oligonucleótidos para una unión de alta afinidad con sustratos específicos. [ 46 ]
En los biosensores electroquímicos de miRNA, las AuNP permiten una fácil funcionalización para reacciones electroquímicas que implican cambios en el potencial, la corriente, la conductividad o la impedancia en la detección de la unión del miRNA objetivo en la superficie de detección. [ 46 ] En los biosensores ópticos, las AuNP exhiben propiedades ópticas únicas y ajustables beneficiosas para los biosensores de miRNA SPR. [ 46 ] Cuando las AuNP se exponen a la luz, se crean plasmones de superficie propagantes necesarios para detectar los miRNA unidos al receptor a partir de una interacción resonante entre el campo electromagnético de la luz y las oscilaciones cargadas de electrones en la superficie del metal. Esto se debe a que las AuNP exhiben una alta densidad de electrones en la banda de conducción y su tamaño de nanopartícula permite múltiples desplazamientos angulares para más ángulos de reflectancia. [ 46 ] [ 47 ]
  • Grafeno : El grafeno pertenece a la familia de los nanomateriales de carbono y destaca por su biocompatibilidad, conductividad eléctrica, bajo peso molecular, estabilidad y asequibilidad, lo que lo convierte en una opción excepcional para aplicaciones de biosensores de miRNA. Demuestra una excelente respuesta a estímulos químicos, ópticos y mecánicos. El grafeno se utiliza principalmente en biosensores de miRNA eléctricos y ópticos. [ 48 ] Una aplicación reciente notable implica el uso de grafeno poroso autodopado con nitrógeno inducido por láser en biosensores de miRNA, capaz de detectar miRNA hsa-miR-486-5p en concentraciones tan bajas como 10 fM. Este enfoque combina rentabilidad con alta reproducibilidad, ofreciendo ventajas significativas para afecciones como la preeclampsia. [ 49 ]
  • Metamaterial de terahercios (THz) con nanopartículas de oro: El metamaterial de THz se sintetiza artificialmente y se diseña para interactuar con ondas de frecuencia THz. Al combinarse con nanopartículas de oro (AuNPs) y tras unirse al miRNA objetivo, produce cambios más pronunciados en las regiones espectrales de THz. Por ejemplo, un biosensor de miRNA basado en estos materiales podría detectar el miRNA-21 en muestras clínicas con un límite de detección (LoD) de 14,54 aM. [ 45 ]

Tecnologías y principios de los biosensores de miRNA multiplex

Los biosensores de miRNA multiplex están diseñados para detectar múltiples tipos de miRNA simultáneamente con alta especificidad y sensibilidad. Esta capacidad es esencial por varias razones: Primero, permite detectar diversos miRNA dentro de una sola muestra que pueden contribuir a la enfermedad, lo que posibilita un monitoreo integral durante el tratamiento y facilita el cribado de alto rendimiento. Segundo, puede reducir significativamente el costo y el tiempo al permitir el análisis simultáneo de datos de múltiples miRNA. [ 50 ] [ 51 ] A continuación, se presentan algunas tecnologías recientes en biosensores de miRNA multiplex:

  • DNA-PAINT, basado en una plataforma de sensores de ADN origami, es un biosensor de miRNA con un sistema de codificación geométrica único que permite detectar hasta 4 miRNAs simultáneamente. Los  intervalos de 52 nm entre las hebras posibilitan que la plataforma distinga entre desajustes individuales con un límite de detección (LoD) de 11 fM a 388 fM. [ 52 ]
  • CRISPR - Biosensor Multiplex - esta plataforma utiliza diversas tecnologías, incluyendo microfluídica electroquímica y Cas13a, para permitir la detección sin amplificación de ocho miRNAs. Presenta un diseño con cuatro canales divididos para el análisis electroquímico. [ 53 ]

Aplicaciones

Aplicaciones diagnósticas y pronósticas

Desde el descubrimiento inicial de los miRNAs, se han identificado grandes bases de datos de miRNAs en humanos, plantas y animales. Dado que muchos miRNAs están asociados con el inicio y desarrollo de enfermedades, son un biomarcador adecuado para la detección mediante biosensores en entornos clínicos. [ 1 ] Se deben tener en cuenta las consideraciones sobre la fuente de la muestra biológica para los objetivos de miRNA. El análisis de muestras clínicas de miRNA suele provenir de sangre, plasma, suero, líquido seminal, saliva, orina y miRNAs derivados de tejidos. [ 54 ] En el contexto del cáncer, la detección de miRNAs mediante biosensores se realiza de manera más conveniente en forma de biopsias líquidas, ya que los miRNAs circulantes se encuentran en mayor abundancia en muestras líquidas. [ 55 ]

  • Pruebas en el punto de atención (POC)
La investigación sobre pruebas de diagnóstico en el punto de atención (POC) ha dado como resultado el desarrollo de biosensores microfluídicos capaces de realizar análisis clínicos de diagnóstico temprano de miRNAs asociados al cáncer, que producen resultados rentables y rápidos con mayor sensibilidad y especificidad que los métodos tradicionales. [ 56 ] Los biosensores microfluídicos basados ​​en gotas de biopsia líquida se pueden fabricar en dispositivos POC para facilitar su uso mediante la integración con dispositivos e interfaces preexistentes y pueden extender su utilización más allá de los entornos de laboratorio tradicionales y aquellos sin instrumentos sofisticados. [ 57 ] Un ejemplo de los avances en las pruebas POC para el cáncer de próstata es donde se detectó miR-21 en bajas concentraciones de muestras de orina con un límite de detección de 2 nM en chips biosensores electroquímicos basados ​​en etiquetas impresas en serigrafía. La detección fue rápida, con resultados producidos en menos de dos horas. [ 58 ]

Gestión agrícola

Además de su uso clínico, los biosensores de miRNA se han adaptado para el manejo del estrés de las plantas agrícolas y el análisis del crecimiento y las enfermedades, ya que los miRNA de las plantas están asociados con mecanismos reguladores del crecimiento. Un ejemplo son los biosensores electroquímicos fabricados para detectar miR-319a, un miRNA asociado con la respuesta a fitohormonas que regula el crecimiento de las plántulas de arroz. La amplificación de la señal catalítica de la fosfatasa alcalina isotérmica de las hebras de miRNA objetivo se integró con un sistema de tres electrodos para detectar miR319a a niveles de LoD de 1,7 fM. [ 59 ] Se probaron biosensores ópticos basados ​​en etiquetas de AuNp para detectar miRNA-1886, un indicador de estrés por sequía en plantas de tomate. Encontraron que la disminución de los niveles de riego aumentó la concentración de miRNA-1886 en un rango de 100 a 6800 fM. [ 60 ]

Aplicaciones de investigación

1. Biología molecular y celular

Dado que los miRNA son uno de los principales reguladores de los genes, su detección y medición a nivel celular y molecular puede ser útil para descifrar las interacciones de los miRNA con otras moléculas. Por ejemplo, un estudio de Bandi et al. encontró que miR-15a y miR-16 funcionan en la tumorigénesis de líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP). [ 61 ] Los biosensores de miRNA también tienen un papel importante en la elucidación de los mecanismos de las enfermedades. Por ejemplo, un estudio sobre enfermedades cardiovasculares encontró que los biosensores de miRNA basados ​​en nanoestructuras de tetraedros de ADN pueden reconocer miR-133a en niveles aM, lo que es útil para estudios posteriores sobre el infarto de miocardio. [ 62 ]

2. Descubrimiento y desarrollo de fármacos

Debido a su alto potencial de procesamiento, los biosensores de miRNA pueden acelerar significativamente el descubrimiento de fármacos al evaluar diversos fármacos en función de los niveles de expresión de miRNA para observar qué fármaco puede dirigirse a los miRNA no regulados en las enfermedades. Además, los biosensores de miRNA pueden monitorizar la expresión de miRNA en tiempo real para observar qué cambios se producen en diferentes concentraciones de fármacos, lo cual es especialmente crucial en los ensayos clínicos de fase temprana para la optimización de la dosis de los fármacos. Asimismo, al analizar diversas expresiones de miRNA, los investigadores pueden descubrir relaciones entre las enfermedades y la expresión de miRNA [ 63 ] [ 64 ] [ 65 ].

Limitaciones de los biosensores de miRNA

Si bien los biosensores de miRNA son muy prometedores para la detección de miRNA, es necesario abordar varios desafíos críticos:

  • Sensibilidad y especificidad: La baja abundancia de miRNAs en muestras biológicas complejas, como la sangre, exige mejorar la sensibilidad de los biosensores para detectar miRNAs en concentraciones superiores a los femtomolares. Además, debido a la alta similitud de secuencia entre los miRNAs, mejorar la especificidad de estos biosensores es esencial para diferenciarlos basándose en diferencias de un solo nucleótido. [ 66 ]
  • Preparación de muestras: La extracción de miRNAs de las muestras presenta dificultades significativas. El proceso es complejo y requiere optimización para garantizar la pureza e integridad de los miRNAs para una detección precisa. [ 67 ]
  • Estabilidad del biosensor de miRNA: La estabilidad de los biosensores de miRNA se ve comprometida por las condiciones ambientales, especialmente en el caso de componentes como aptámeros y anticuerpos. Este problema es particularmente relevante para los dispositivos de diagnóstico en el punto de atención (POC), que requieren robustez y durabilidad para su uso efectivo en diversos entornos. [ 68 ]
  • Estandarización: Una limitación importante en este campo es la ausencia de directrices estandarizadas y de miRNAs de referencia universales para comparar resultados entre muestras de sangre y plasma. Establecer normalizadores fiables, caracterizados por una expresión y estabilidad consistentes en todas las muestras, es crucial para interpretar con precisión los niveles de miRNA. [ 69 ] [ 70 ] [ 71 ]

Abordar estos desafíos es fundamental para el avance y la adopción de las tecnologías de biosensores de miRNA.

Direcciones futuras

La importancia del miRNA en el diagnóstico y los recientes avances en su detección a partir de diversas fuentes de muestras, especialmente en entornos clínicos, subrayan la necesidad de mejorar las tecnologías de biosensores de miRNA. El futuro de la optimización de los biosensores de miRNA abarca varias áreas clave:

  • Fomento de la investigación sobre la integración de nanomateriales : Los materiales, incluidos el grafeno, las nanopartículas de oro y los puntos cuánticos, pueden mejorar significativamente la especificidad y la sensibilidad de los biosensores, haciéndolos más eficaces en la detección de miRNAs. [ 72 ]
  • Detección multiplex: Se están realizando esfuerzos para perfeccionar los biosensores de miRNA para la detección simultánea de múltiples tipos de miRNA, especialmente aquellos dentro de la misma familia, a partir de muestras de pequeño volumen; en este sentido, la inteligencia artificial puede ayudar a distinguir entre los tipos de miRNA y correlacionarlos con los resultados clínicos. Estos avances serían particularmente beneficiosos para los dispositivos de punto de atención (POC), ya que simplificarían la preparación de muestras, mejorarían la facilidad de uso y permitirían a los médicos monitorizar los niveles de miRNA en tiempo real de forma remota. [ 67 ]
  • Tecnologías de encapsulación : Las tecnologías de encapsulación tienen como objetivo proteger los componentes sensibles de los biosensores de las amenazas ambientales, asegurando su durabilidad y fiabilidad. [ 73 ]
  • Estandarización de la investigación y el desarrollo de miRNA: El desarrollo de directrices estandarizadas y la identificación de genes universales para la comparación de la expresión de miRNA facilitarán la evaluación precisa de los biosensores de miRNA en diferentes escenarios clínicos. [ 1 ]
  • Análisis de muestras clínicas: El estudio de análisis prospectivos y retrospectivos de muestras clínicas y la comparación de los resultados de biosensores de miRNA con los obtenidos mediante qPCR en tiempo real y tecnologías de secuenciación pueden evaluar el rendimiento de los biosensores en diversas condiciones clínicas. [ 74 ] [ 75 ]

Estos avances sugieren una trayectoria bien definida para el desarrollo de biosensores de miRNA, orientada a mejoras tecnológicas que prometen mejores capacidades de diagnóstico y aplicaciones clínicas.

Referencias

  1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Kilic, Tugba; Erdem, Arzum; Ozsoz, Mehmet; Carrara, Sandro (2018-01-15). "Biosensores de microARN: Oportunidades y desafíos entre técnicas convencionales y disponibles comercialmente" . Biosensores y Bioelectrónica . 99 : 525–546 . doi : 10.1016/j.bios.2017.08.007 . ISSN 0956-5663 . PMID 28823978 .  
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