Secuenciación de lecturas vinculadas

La secuenciación de lectura enlazada se basa en microfluidos y solo necesita nanogramos de ADN de entrada. ^{[ 2 ]} Un nanogramo de ADN puede distribuirse en más de 100 000 particiones de gotas, donde los fragmentos de ADN se codifican y se someten a reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) . ^{[ 2 ]} Como resultado, los fragmentos de ADN (o lecturas ) que comparten el mismo código de barras pueden agruparse como provenientes de una única secuencia larga de ADN de entrada. ^{[ 2 ]} Y, se puede ensamblar información de largo alcance a partir de lecturas cortas.

Pasos de la secuenciación de lectura enlazada: ^{[ 2 ]}

1. Preparación de la muestra: El ADN se extrae de una muestra (por ejemplo, sangre) y se corta en fragmentos de entre 50 y 200 kilopares de bases de longitud.
2. Secuenciación por código de barras: cada fragmento de ADN se etiqueta con un código de barras único mediante un proceso conocido como "Emulsión en perlas de gel" (GEM, por sus siglas en inglés).
3. Preparación de la biblioteca : los fragmentos de ADN con código de barras se amplifican mediante PCR para generar bibliotecas de secuenciación.
4. Secuenciación: con la tecnología de secuenciación de próxima generación de Illumina , se generan millones o miles de millones de lecturas de secuencias cortas que representan fragmentos de las moléculas de ADN originales.
5. Procesamiento de códigos de barras: agrupar lecturas cortas en fragmentos más largos basándose en códigos de barras.
6. Análisis posterior: las lecturas procesadas se alinean con un genoma de referencia o se utilizan para el ensamblaje de novo de genomas complejos, la determinación de fases de haplotipos o la identificación de variaciones estructurales.

Durante la secuenciación de códigos de barras, las muestras de ADN de alto peso molecular que contienen la secuencia de ADN objetivo, con tamaños que oscilan entre cincuenta y varios cientos de kilobases , se combinan con microesferas de gel que contienen códigos de barras únicos, enzimas y reactivos de secuenciación. ^{[ 2 ]} Un dispositivo microfluídico puede dividir las moléculas de ADN de entrada en gotas individuales de tamaño nanométrico de emulsión de agua en aceite, llamadas GEM. ^{[ 2 ]} Cada GEM contiene microesferas de gel recubiertas con el mismo código de barras y cebadores, y una pequeña cantidad de ADN. ^{[ 2 ]} Los cebadores son complementarios a regiones específicas de la molécula de ADN, lo que permite la amplificación del ADN en las gotas mediante PCR. ^{[ 2 ]} Los códigos de barras permiten la identificación y agrupación de lecturas de secuenciación que se originan del mismo fragmento largo, lo cual es crucial para el análisis posterior. ^{[ 2 ]}

Los fragmentos de ADN con código de barras se amplifican mediante PCR para crear una biblioteca de fragmentos de ADN con códigos de barras idénticos. Todos los fragmentos derivados de una molécula de ADN determinada se etiquetan con el mismo código de barras. ^{[ 4 ]} Este paso aumenta la cantidad de ADN para la secuenciación y reduce las posibilidades de perder fragmentos de ADN únicos durante la secuenciación. Posteriormente, las gotas (o GEM) se recogen en un tubo y se rompe la emulsión, liberando las secuencias de ADN amplificadas con código de barras.

La tecnología estándar de secuenciación de próxima generación de Illumina se puede utilizar para secuenciar bibliotecas. ^{[ 5 ]} Durante la secuenciación, los códigos de barras se leen junto con las secuencias de ADN, lo que permite a los investigadores y científicos agrupar fragmentos de ADN que se originan de la misma molécula de ADN. ^{[ 5 ]} Aunque cada fragmento de ADN no se secuencia completamente, la información de muchos fragmentos superpuestos en la misma región genómica se puede combinar para reconstruir largos segmentos del genoma. ^{[ 5 ]} Por lo tanto, un genoma se puede ensamblar fácilmente desde cero sin ninguna referencia previa.

Los datos de secuenciación brutos se procesan mediante bioinformática (por ejemplo, el software de análisis GemCode desarrollado por 10x Genomics) para eliminar las lecturas de baja calidad y asignarles sus respectivos códigos de barras. ^{[ 2 ]} Las lecturas se pueden alinear con un genoma de referencia o ensamblar de novo para generar contigs de largo alcance . El paso de alineación de lecturas es importante para determinar el orden y la orientación de los fragmentos largos de ADN, y para identificar variaciones genómicas, como inserciones o deleciones .

La secuenciación de lectura enlazada puede facilitar el ensamblaje de novo del genoma , que implica reconstruir un genoma desde cero sin ninguna referencia previa. La secuenciación de lectura enlazada permite el ensamblaje de grandes regiones genómicas y ayuda a mejorar la completitud y la contigüidad del genoma resultante. Esto puede ser particularmente útil para estudiar organismos que carecen de un genoma de referencia de alta calidad, como organismos no modelo u organismos con genomas complejos. ^{[ 6 ]} Muchos científicos han estado utilizando la tecnología de secuenciación de lectura enlazada para el ensamblaje de novo del genoma recientemente en una variedad de organismos, incluidos humanos, plantas y animales. ^{[ 7 ] [ 6 ] [ 8 ]} Por ejemplo, el Dr. Evan Eichler y su grupo de investigación utilizaron la secuenciación de lectura enlazada para ensamblar el genoma del orangután , que anteriormente había sido difícil de estudiar debido a su genoma complejo. ^{[ 8 ]} El ensamblaje del genoma resultante ayudó a los científicos a estudiar nuevas perspectivas sobre la historia evolutiva de los primates y la base genética de las enfermedades humanas. ^{[ 8 ]} Además, las lecturas alineadas o ensambladas pueden utilizarse para otras investigaciones genéticas o análisis posteriores, como la determinación de fases de haplotipos.

Haplotipo se refiere a un grupo de variantes genéticas heredadas juntas en un cromosoma de uno de los padres debido a su ligamiento genético . La fase de haplotipos (también llamada estimación de haplotipos ) se refiere al proceso de reconstrucción de haplotipos individuales, importante para determinar la base genética de las enfermedades. ^{[ 9 ]} La secuenciación de lecturas vinculadas permite una cobertura consistente de genes relacionados con diferentes enfermedades, lo que ayuda a los científicos a obtener todas las regiones que portan mutaciones de los genes objetivo. ^{[ 10 ]} Por ejemplo, en 2018, un grupo de investigadores utilizó la tecnología de secuenciación de lecturas vinculadas para secuenciar información genética de una mujer embarazada que era portadora de la mutación de la distrofia muscular de Duchenne (DMD). ^{[ 10 ]} La secuenciación de lecturas vinculadas les permite identificar los haplotipos maternos y determinar la presencia de los alelos mutantes en el ADN fetal. ^{[ 10 ]} Este diagnóstico prenatal no invasivo de DMD demuestra la aplicabilidad clínica de la secuenciación de lecturas vinculadas.

Las variaciones estructurales , como deleciones, duplicaciones , inversiones, translocaciones y otros reordenamientos, son comunes en los genomas humanos. ^{[ 4 ]} Estas variaciones pueden tener impactos significativos en las funciones del genoma y se han relacionado con muchas enfermedades. La tecnología de secuenciación de lecturas vinculadas etiqueta todas las lecturas que se originan del mismo fragmento largo de ADN con el mismo código de barras, lo que permite la detección de un gran número de variantes estructurales. ^{[ 4 ]} La complejidad de las variantes estructurales se puede resolver con la secuenciación de lecturas vinculadas y proporciona una imagen completa del panorama genómico. Muchos científicos ya han estado utilizando la secuenciación de lecturas vinculadas para identificar y caracterizar variantes estructurales en diversas poblaciones, incluidas personas con trastornos genéticos o cánceres. ^{[ 11 ]}

El análisis del transcriptoma es el estudio de todos los transcritos de ARN producidos por el genoma de un organismo. La secuenciación de lecturas enlazadas ha sido utilizada por los investigadores para ensamblar isoformas de transcritos y eventos de empalme alternativo . ^{[ 12 ]} La información sobre los eventos de empalme alternativo puede proporcionar información sobre la regulación de la expresión génica en el transcriptoma humano. ^{[ 12 ]}

La epigenética se refiere al estudio de los cambios hereditarios en las actividades genéticas que son distintos de los cambios en las secuencias de ADN. El análisis epigenético implica el estudio de las interacciones ADN-proteína, las modificaciones de histonas y la metilación del ADN . La secuenciación de lecturas vinculadas se ha utilizado para estudiar los patrones de metilación del ADN en muchos estudios. ^{[ 13 ] [ 14 ]} Por ejemplo, en 2021, un estudio investigó las diferencias de metilación del ADN en células de sangre periférica entre gemelos, en los que un gemelo tenía la enfermedad de Alzheimer y el otro era cognitivamente normal. ^{[ 13 ]} La tecnología de secuenciación de lecturas vinculadas permitió a los investigadores identificar más de 3000 regiones diferencialmente metiladas entre estos gemelos discordantes para la enfermedad de Alzheimer , y la investigación de estas regiones diferencialmente metiladas finalmente condujo a la identificación de genes enriquecidos en procesos de neurodesarrollo, señalización neuronal y funciones del sistema inmunitario . ^{[ 13 ]}

• Amplia gama de aplicaciones genómicas y cuestiones científicas, incluyendo el ensamblaje de novo del genoma, la determinación de fases de haplotipos, el análisis de variantes estructurales y el análisis transcriptómico y epigenético.
• Precisión y escalabilidad.
• El método requiere pequeñas cantidades de ADN de entrada, lo que puede ser beneficioso para muestras pequeñas o estudios de células individuales. ^{[ 2 ]}
• Más rentable por muestra en comparación con tecnologías de lectura larga como la secuenciación Oxford Nanopore . ^{[ 3 ]}
• Las bibliotecas producidas por lectura enlazada pueden procesarse utilizando la secuenciación de lectura corta de Illumina, lo que aumenta la accesibilidad. ^{[ 2 ] [ 3 ]}

• Complejidad de la construcción de la biblioteca: esta tecnología requiere una preparación de ADN de alto peso molecular para producir moléculas de ADN lo suficientemente largas para la secuenciación. ^{[ 3 ]}
• Las limitaciones en la longitud de lectura pueden resultar en una resolución de haplotipo limitada, lo que podría reducir la eficacia de esta tecnología en regiones genómicas altamente complejas. ^{[ 2 ] [ 3 ]}