Biblioteca de saltos

El salto cromosómico (o desplazamiento cromosómico) fue descrito por primera vez en 1984 por Collins y Weissman. ^{[ 1 ]} En aquel entonces, las técnicas de clonación permitían generar clones de tamaño limitado (hasta 240 kb), y las técnicas citogenéticas permitían mapear dichos clones a una pequeña región de un cromosoma específico con una resolución de alrededor de 5-10 Mb. Por lo tanto, persistía una brecha importante en la resolución entre las tecnologías disponibles, y no existían métodos para mapear áreas más extensas del genoma. ^{[ 1 ]}

Esta técnica es una extensión del "recorrido cromosómico" que permite pasos más grandes a lo largo del cromosoma. Si se desean pasos de longitud N kb, se requiere ADN de muy alto peso molecular. Una vez aislado, se digiere parcialmente con una enzima de restricción de corte frecuente (como MboI o BamHI ). A continuación, se seleccionan los fragmentos obtenidos por su tamaño, que debe ser de aproximadamente N kb. El ADN debe ligarse a baja concentración para favorecer la ligación en círculos en lugar de la formación de multímeros. En este punto, se puede incluir un marcador de ADN (como el gen supresor de ARNt ámbar supF) dentro del círculo unido covalentemente para permitir la selección de fragmentos de unión. Posteriormente, los círculos se digieren completamente con una segunda enzima de restricción (como EcoRI ) para generar un gran número de fragmentos. Dichos fragmentos se ligan a vectores (como un vector λ) que deben seleccionarse utilizando el marcador de ADN introducido anteriormente. Los fragmentos restantes representan así la biblioteca de fragmentos de unión, o "biblioteca de salto". ^{[ 1 ]} El siguiente paso es examinar esta biblioteca con una sonda que representa un "punto de partida" del "salto cromosómico" deseado, es decir, determinar la ubicación del genoma que se está analizando. Los clones obtenidos de este paso de selección final consistirán en ADN homólogo a nuestra sonda, separado por nuestro marcador de ADN de otra secuencia de ADN que originalmente se encontraba a N kb de distancia (de ahí el término "salto"). ^{[ 1 ]} Al generar varias bibliotecas con diferentes valores de N, finalmente se puede mapear todo el genoma, permitiendo el movimiento de una ubicación a otra, controlando la dirección, mediante cualquier valor de N deseado. ^{[ 1 ]}

La técnica original de salto cromosómico fue desarrollada en los laboratorios de Collins y Weissman en la Universidad de Yale en New Haven, EE. UU. ^{[ 1 ]} y en los laboratorios de Poustka y Lehrach en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular en Heidelberg, Alemania. ^{[ 2 ]}

El método de Collins y Weissman ^{[ 1 ]} descrito anteriormente presentó algunas limitaciones iniciales. La principal preocupación radicaba en evitar fragmentos no circularizados. Se propusieron dos soluciones: o bien analizar los fragmentos de unión con una sonda específica, o bien añadir una segunda etapa de selección de tamaño tras la ligación para separar los clones circulares individuales (monómeros) de los clones ligados entre sí (multímeros). Los autores también sugirieron considerar otros marcadores, como el sitio cos λ o los genes de resistencia a antibióticos (en lugar del gen del ARNt supresor ámbar), para facilitar la selección de los clones de unión.

Poustka y Lehrach ^{[ 2 ]} sugirieron que la digestión completa con enzimas de restricción de corte poco frecuente (como NotI) debería utilizarse como primer paso en la construcción de la biblioteca, en lugar de la digestión parcial con una enzima de restricción de corte frecuente. Esto reduciría significativamente el número de clones de millones a miles. Sin embargo, esto podría generar problemas con la circularización de los fragmentos de ADN, ya que estos serían muy largos, y también se perdería la flexibilidad en la elección de los puntos finales que se obtiene con las digestiones parciales. Una sugerencia para superar estos problemas sería combinar ambos métodos, es decir, construir una biblioteca de salto a partir de fragmentos de ADN digeridos parcialmente con una enzima de restricción de corte común y completamente con una enzima de restricción de corte poco frecuente, y circularizarlos en plásmidos clivados con ambas enzimas. Varias de estas bibliotecas de "combinación" se completaron en 1986. ^{[ 2 ] [ 3 ]}

En 1991, Zabarovsky et al. ^{[ 4 ]} propusieron un nuevo método para la construcción de bibliotecas de salto. Este método incluía el uso de dos vectores λ separados para la construcción de la biblioteca y una reacción de relleno parcial que eliminaba la necesidad de un marcador seleccionable . Esta reacción de relleno funcionaba destruyendo los extremos cohesivos específicos (resultantes de digestiones con enzimas de restricción) de los fragmentos de ADN que no estaban ligados ni circularizados, impidiendo así su clonación en los vectores, de una manera más eficiente energéticamente y precisa. Además, esta técnica mejorada requería menos ADN para empezar y también producía una biblioteca que podía transferirse a un plásmido, facilitando su almacenamiento y replicación. Utilizando este nuevo método, construyeron con éxito una biblioteca de salto NotI humana a partir de una línea celular linfoide y una biblioteca de salto NotI específica del cromosoma 3 humano a partir de una línea celular híbrida de ratón y cromosoma 3 humano . ^{[ 4 ]}

Una biblioteca se prepara a menudo mediante la fragmentación aleatoria de ADN y la ligación de secuencias adaptadoras comunes. ^{[ 5 ] [ 6 ]} Sin embargo, las lecturas cortas generadas dificultan la identificación de variantes estructurales, como inserciones/deleciones, translocaciones y duplicaciones. Las grandes regiones de repeticiones simples pueden complicar aún más la alineación. ^{[ 7 ]} Como alternativa, se puede utilizar una biblioteca de salto con NGS para el mapeo de la variación estructural y el andamiaje de ensamblajes de novo. ^{[ 8 ]}

Las bibliotecas de ADN con capacidad de salto se pueden clasificar según la longitud de los fragmentos de ADN incorporados.

Los segmentos resultantes de la circularización durante la construcción de la biblioteca de salto se escinden, y los fragmentos de ADN con marcadores se enriquecen y se someten a secuenciación de extremos apareados. Estos fragmentos de ADN se secuencian desde ambos extremos y generan pares de lecturas. La distancia genómica entre las lecturas de cada par se conoce aproximadamente y se utiliza para el proceso de ensamblaje. Por ejemplo, un clon de ADN generado por fragmentación aleatoria tiene aproximadamente 200 pb, y una lectura de cada extremo tiene alrededor de 180 pb, solapándose entre sí. Esto debe distinguirse de la secuenciación de pares de extremos, que es básicamente una combinación de secuenciación de nueva generación con bibliotecas de salto.

Se han desarrollado diferentes herramientas de ensamblaje para manejar datos de bibliotecas de salto. Un ejemplo es DELLY. DELLY se desarrolló para descubrir variantes estructurales genómicas e integra alineamientos de extremos emparejados de inserción corta, pares de extremos de largo alcance y lecturas divididas para detectar reordenamientos a nivel de secuencia. ^{[ 11 ]}

Un ejemplo de desarrollo conjunto de un nuevo diseño experimental y desarrollo de algoritmos lo demuestra el ensamblador ALLPATHS-LG. ^{[ 12 ]}

Cuando se utilizan para la detección de cambios genéticos y genómicos, los clones saltarines requieren validación mediante secuenciación de Sanger .

En sus inicios, el rastreo cromosómico a partir de marcadores de ADN genéticamente ligados se utilizaba para identificar y clonar genes causantes de enfermedades. Sin embargo, la gran distancia molecular entre los marcadores conocidos y el gen de interés complicaba el proceso de clonación. En 1987, se construyó una biblioteca de salto cromosómico humano para clonar el gen de la fibrosis quística. La fibrosis quística es una enfermedad autosómica recesiva que afecta a 1 de cada 2000 personas de raza caucásica. Esta fue la primera enfermedad en la que se demostró la utilidad de las bibliotecas de salto. El oncogén Met era un marcador estrechamente ligado al gen de la fibrosis quística en el cromosoma 7 humano, y se analizó la biblioteca en busca de un clon de salto que comenzara en este marcador. Se determinó que el gen de la fibrosis quística se localizaba 240 kb corriente abajo del gen Met. El salto cromosómico ayudó a reducir los "pasos" de mapeo y a evitar las regiones altamente repetitivas del genoma de los mamíferos. ^{[ 13 ]} El salto cromosómico también permitió la producción de sondas necesarias para un diagnóstico más rápido de esta y otras enfermedades. ^{[ 1 ]}

El coste de la secuenciación ha disminuido drásticamente, mientras que el de la construcción de bibliotecas de secuenciación no. Por lo tanto, a medida que se desarrollen nuevas tecnologías de secuenciación y herramientas bioinformáticas, las bibliotecas de secuenciación podrían volverse obsoletas.