Enlace isopeptídico

En cuanto a los enlaces isopeptídicos que unen una proteína a otra con el propósito de transducción de señales, la literatura está dominada por la ubiquitina y otras proteínas similares. La ubiquitina y sus proteínas relacionadas ( SUMO , Atg8 , Atg12 , etc.) tienden a seguir una vía de ligación de proteínas relativamente similar. ^{[ 6 ]}

El proceso de ligación de proteínas por ubiquitina y proteínas similares a la ubiquitina tiene tres pasos principales. ^{[ 6 ]} En el paso inicial, la proteína activadora específica (E1 o proteína similar a E1) activa la ubiquitina adenilándola con ATP . ^{[ 6 ]} Luego, la ubiquitina adenilada puede transferirse a una cisteína conservada usando un enlace tioéster que está entre el grupo carboxilo de la glicina C-terminal de la ubiquitina y el azufre de la cisteína E1. ^{[ 6 ] [ 14 ] [ 8 ]} La enzima activadora E1 luego se une y transfiere la ubiquitina al siguiente nivel, la enzima E2 que acepta la proteína y una vez más forma un tioéster con un enlace conservado. La E2 actúa en cierta medida como un intermediario que luego se une a la enzima ligasa E3 para el nivel final, lo que conduce a la eventual transferencia de la ubiquitina o proteína relacionada con la ubiquitina a un sitio de lisina en la proteína objetivo, o más comúnmente para la ubiquitina, a la propia ubiquitina para formar cadenas de dicha proteína. ^{[ 14 ]}

Sin embargo, en el nivel final, también existe una divergencia, ya que, dependiendo del tipo de ligasa E3, es posible que no sea ella quien cause la conjugación. Existen ligasas E3 que contienen dominios HECT, las cuales continúan esta "cadena de transferencia" aceptando nuevamente la ubiquitina a través de otra cisteína conservada y luego dirigiéndola y transfiriéndola al objetivo deseado. Sin embargo, en el caso de las ligasas que contienen dominios de dedo RING, las cuales utilizan enlaces de coordinación con iones de zinc para estabilizar sus estructuras, actúan más como directoras de la reacción. Esto significa que, una vez que la ligasa E3 de dedo RING se une a la E2 que contiene la ubiquitina, simplemente actúa como un dispositivo de direccionamiento que dirige a la E2 para que ligue directamente la proteína objetivo en el sitio de lisina. ^{[ 14 ] [ 15 ]}

Aunque en este caso la ubiquitina representa bien a otras proteínas relacionadas, cada proteína obviamente tendrá sus propios inconvenientes, como SUMO, que tiende a ser una ligasa con dominio de dedo anular, donde la E3 simplemente actúa como dispositivo de direccionamiento para dirigir la ligación por la E2, y no realiza la reacción en sí misma como las ligasas E3-HECT de ubiquitina. ^{[ 8 ]} Por lo tanto, si bien los mecanismos internos difieren, como la forma en que las proteínas participan en la cadena de transferencia, los aspectos químicos generales, como el uso de tioésteres y ligasas específicas para el direccionamiento, permanecen iguales.

La química enzimática involucrada en la formación de isopeptidos con fines estructurales es diferente a la del caso de la ubiquitina y las proteínas relacionadas con ella. En este caso, en lugar de pasos secuenciales que involucran múltiples enzimas para activar, conjugar y dirigir el sustrato, ^{[ 16 ]} la catálisis es realizada por una sola enzima y el único paso precursor, si lo hay, generalmente es la escisión para activarlo a partir de un zimógeno. Sin embargo, la uniformidad que existe en el caso de la ubiquitina no se da aquí, ya que hay numerosas enzimas diferentes que realizan la reacción de formación del enlace isopeptídico.

El primer caso es el de las sortasas, una familia de enzimas presente en numerosas bacterias grampositivas. Se ha demostrado que son un importante factor de patogenicidad y virulencia. La reacción general que realizan las sortasas implica el uso de su propia versión de la "tríada catalítica": es decir, histidina, arginina y cisteína para el mecanismo reactivo. La histidina y la arginina ayudan a crear el entorno reactivo, y la cisteína actúa como centro de reacción mediante un tioéster que ayuda a mantener un grupo carboxilo hasta que la amina de una lisina pueda realizar un ataque nucleofílico para transferir la proteína y formar el enlace isopeptídico. Un ion que a veces puede desempeñar un papel importante, aunque indirecto, en la reacción enzimática es el calcio, al que se une la sortasa. Juega un papel importante al mantener la estructura de la enzima en la conformación óptima para la catálisis. Sin embargo, hay casos en los que se ha demostrado que el calcio no es esencial para que tenga lugar la catálisis. ^{[ 17 ]}

Otro aspecto que distingue a las sortasas en general es que tienen una especificidad muy marcada para su sustrato, ya que las sortasas generalmente tienen dos funciones: la primera es la fusión de proteínas a la pared celular de las bacterias y la segunda es la polimerización de la pilina. Para el proceso de localización de proteínas en la pared celular, se requiere que la proteína contenga un dominio hidrofóbico, una región de cola con carga positiva y una secuencia final específica utilizada para el reconocimiento. ^{[ 12 ]} La señal mejor estudiada es la LPXTG, que actúa como punto de escisión, donde la sortasa ataca entre Thr y Gly, conjugándose al grupo carboxilo de Thr. ^{[ 17 ]} Luego, el tioéster se resuelve mediante la transferencia del péptido a una amina primaria, y esto generalmente tiene una especificidad muy alta, lo que se ve en el ejemplo de B. cereus donde la enzima sortasa D ayuda a polimerizar la proteína BcpA a través de dos señales de reconocimiento, el LPXTG como punto de escisión y formación de tioéster, y el sitio YPKN que actúa como señal de reconocimiento donde se formará el isopeptido. ^{[ 18 ]} Si bien los detalles pueden variar entre bacterias, los fundamentos de la química enzimática de la sortasa permanecen iguales.

El siguiente caso es el de las transglutaminasas (TGasas), que actúan principalmente en eucariotas para fusionar diferentes proteínas por diversas razones, como la cicatrización de heridas o la unión de proteínas a membranas lipídicas. ^{[ 19 ] [ 20 ]} Las TGasas también contienen su propia "tríada catalítica" con histidina, aspartato y cisteína. Las funciones de estos residuos son análogas o idénticas a las de las sortasas descritas anteriormente, ya que la histidina y el aspartato desempeñan un papel de apoyo al interactuar con el residuo diana, mientras que la cisteína forma un tioéster con un grupo carboxilo para un posterior ataque nucleofílico por una amina primaria, en este caso, debido al interés de la lisina. Sin embargo, las similitudes catalíticas con la sortasa comienzan a terminar ahí, ya que la enzima y la familia dependen del calcio, que desempeña un papel estructural crucial para mantener una conformación estrecha de la enzima. Las TGasas también presentan una especificidad de sustrato muy diferente, ya que se dirigen específicamente a la glutamina central, en la secuencia 'Gln-Gln-Val'. La especificidad general del sustrato, es decir, la proteína específica, se debe a la estructura general de las diferentes TGasas, que las dirige hacia el sustrato. ^{[ 19 ]}

Se ha observado especificidad en las TGasas, de modo que diferentes TGasas reaccionan con diferentes Gln en la misma proteína, lo que significa que las enzimas tienen una especificidad inicial muy específica. ^{[ 21 ]} También se ha demostrado que tienen cierta especificidad en cuanto a qué lisina diana transfieren la proteína, como en el caso del Factor XIII, donde el residuo adyacente a la Lys decide si la reacción ocurrirá. ^{[ 20 ]} Por lo tanto, aunque las TGasas pueden parecer inicialmente como una sortasa eucariota, constituyen un conjunto de enzimas independiente.

Otro caso de una enzima de enlace de isopeptido con fines estructurales es el dominio de entrecruzamiento de actina (ACD) de la proteína toxina MARTX generada por V. cholerae. Si bien se ha demostrado que el ACD, al realizar la catálisis, utiliza magnesio y ATP para la formación de los entrecruzamientos, los detalles del mecanismo son inciertos. Un aspecto interesante del entrecruzamiento formado en este caso es que utiliza un Glu no terminal para ligarse a una Lys no terminal, lo que parece ser raro en el proceso de formación de un enlace de isopeptido. ^{[ 13 ]} Aunque la química del ACD aún no se ha dilucidado, muestra que la formación del enlace de isopeptido no depende simplemente de Asp/Asn para los enlaces de isopeptido no terminales entre proteínas.

El último caso a examinar es el curioso caso de las modificaciones postraduccionales de la microtubulina (MT). La MT contiene una amplia gama de modificaciones postraduccionales; sin embargo, las dos de mayor interés son la poliglutamilación y la poliglicilación. Ambas modificaciones son similares en el sentido de que son segmentos repetitivos del mismo aminoácido fusionados al grupo carboxilo de la cadena lateral del glutamato en la región C-terminal de la MT. Los mecanismos enzimáticos no están completamente dilucidados, ya que se sabe poco sobre la enzima poliglicilante. En el caso de la poliglutamilación, el mecanismo exacto también es desconocido, pero parece ser dependiente de ATP. ^{[ 22 ]} Aunque nuevamente hay una falta de claridad con respecto a la química enzimática, aún existe información valiosa sobre la formación de enlaces isopeptídicos utilizando el grupo carboxilo R del Glu junto con el amino N-terminal de los péptidos modificadores.