Compartimentalización in vitro

Las emulsiones de agua en aceite (w/o) se crean mezclando fases acuosas y oleosas con la ayuda de tensioactivos. Una emulsión IVC típica se forma generando primero una mezcla de aceite y tensioactivo mediante agitación, y luego agregando gradualmente la fase acuosa a la mezcla de aceite y tensioactivo. Para la formación de una emulsión estable, se necesita una mezcla de tensioactivos con un equilibrio hidrófilo-lipófilo ( HLB ) y tensioactivos con bajo HLB. ^{[ 3 ]} Algunas combinaciones de tensioactivos utilizados para generar la mezcla de aceite y tensioactivo son aceite mineral / 0,5 % Tween 80 / 4,5 % Span 80 / desoxicolato de sodio ^{[ 1 ]} y una versión más estable al calor, aceite mineral ligero / 0,4 % Tween 80 / 4,5 % Span 80 / 0,05 % Triton X-100 . ^{[ 4 ]} La fase acuosa que contiene componentes de transcripción y/o traducción se agrega lentamente a los surfactantes de aceite, y la formación de w/o se facilita mediante homogeneización, agitación o el uso de un dispositivo de extrusión manual.

La calidad de la emulsión se puede determinar mediante técnicas de microscopía óptica y/o dispersión dinámica de luz . La emulsión es bastante diversa, y mayores velocidades de homogeneización ayudan a producir gotas más pequeñas con una distribución de tamaño más estrecha. Sin embargo, las velocidades de homogeneización deben controlarse, ya que velocidades superiores a 13 500 rpm tienden a producir una pérdida significativa de actividad enzimática a nivel de transcripción. La formación de emulsión más utilizada produce gotas con un diámetro medio de 2-3 μm y un volumen medio de ~5 femtolitros, o 10¹⁰ ^gotas acuosas por ml de emulsión. ^{[ 5 ]} La proporción de genes por gota está diseñada de tal manera que la mayoría de las gotas no contienen más de un solo gen estadísticamente.

La IVC permite la miniaturización de técnicas a gran escala que ahora se pueden realizar a microescala, incluyendo experimentos acoplados de transcripción y traducción in vitro (IVTT). La optimización e integración de la transcripción y la traducción permite diseños experimentales rápidos y altamente controlables. ^{[ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]} La IVTT se puede realizar tanto en emulsiones a granel como en microgotas utilizando microfluídica basada en gotas . Las microgotas, gotas en la escala de pico a femtolitros, se han utilizado con éxito como recipientes para moléculas de ADN individuales. ^{[ 9 ] [ 10 ]} Esta tecnología de gotas permite un análisis de alto rendimiento con muchas presiones de selección diferentes en una sola configuración experimental. ^{[ 6 ] [ 10 ]} La IVTT en microgotas es preferible cuando la sobreexpresión de una proteína deseada sería tóxica para una célula huésped, minimizando la utilidad de los mecanismos de transcripción y traducción. ^{[ 11 ]}

IVC ha utilizado extractos de células bacterianas, germen de trigo y reticulocitos de conejo (RRL) para la transcripción y traducción. También es posible utilizar un sistema de traducción reconstituido bacteriano como PURE, en el que los componentes de la traducción se purifican individualmente y luego se combinan. Al expresar proteínas eucariotas o complejas, es deseable utilizar sistemas de traducción eucariotas como el extracto de germen de trigo o, como alternativa superior, el extracto de RRL. Para utilizar RRL en la transcripción y traducción, no se puede utilizar la formulación de emulsión tradicional, ya que anula la traducción. En su lugar, se desarrolló una nueva formulación de emulsión: 4 % de Abil EM90 / aceite mineral ligero, que demostró ser funcional en la expresión de luciferasa y telomerasa humana . ^{[ 12 ]}

Una vez que la transcripción y/o traducción se ha completado en las gotas, la emulsión se romperá mediante pasos sucesivos de eliminación de aceite mineral y surfactantes para permitir la selección posterior. En esta etapa, es crucial tener un método para "rastrear" cada producto génico hasta el gen codificante a medida que flotan libremente en una población heterogénea de moléculas. Hay tres enfoques principales para rastrear cada fenotipo hasta su genotipo. ^{[ 13 ]} El primer método es unir cada molécula de ADN con un grupo biotina y una secuencia codificante adicional para estreptavidina (presentación STABLE). ^{[ 14 ]} Todas las proteínas/péptidos recién formados estarán fusionados con moléculas de estreptavidina y se unirán a su secuencia codificante biotinilada. Una versión mejorada unió dos moléculas de biotina a los extremos de una molécula de ADN para aumentar la avidez entre la molécula de ADN y los péptidos fusionados con estreptavidina, y utilizó un gen de estreptavidina sintética con bajo contenido de GC para aumentar la eficiencia y especificidad durante la amplificación por PCR. ^{[ 15 ]} El segundo método es unir covalentemente ADN y proteína. Se han demostrado dos estrategias. La primera es formar proteínas de fusión M.HaeIII. ^{[ 16 ]} Cada proteína/polipéptido expresado estará fusionado con el dominio de la ADN metiltransferasa Hae III, que es capaz de unirse covalentemente a fragmentos de ADN que contienen la secuencia 5′-GGC*-3′, donde C* es 5-fluoro-2 deoxicitidina. La segunda estrategia es usar un mutante monomérico de la enzima VirD2. ^{[ 17 ]} Cuando una proteína/péptido se expresa fusionado con la proteína VirD2 de Agrobacterium, se unirá a su secuencia codificante de ADN que tiene un saliente monocatenario que comprende secuencias de reconocimiento del borde T de VirD2. El tercer método es vincular fenotipo y genotipo a través de perlas. ^{[ 18 ]} Las microesferas utilizadas estarán recubiertas con estreptavidina para permitir la unión del ADN biotinilado; además, las microesferas también mostrarán el socio de unión cognado a la etiqueta de afinidad que se expresará en fusión con la proteína/péptido.