Hispanopedia WikiEl análisis de partículas por imagen es una técnica para medir partículas mediante imágenes digitales , una de las técnicas que se engloban bajo el término más amplio de análisis del tamaño de las partículas . Las mediciones que se pueden realizar incluyen el tamaño de las partículas , su forma (morfología o análisis de forma y escala de grises o color ), así como distribuciones (gráficos) de mediciones estadísticas de la población .
Descripción e historia
El análisis de partículas por imagen utiliza técnicas comunes al análisis o procesamiento de imágenes para el análisis de partículas. Aquí, las partículas se definen según el análisis de tamaño de partícula como sólidos particulados, excluyendo así las partículas atómicas o subatómicas. Además, este artículo se limita a imágenes reales (formadas ópticamente), a diferencia de las imágenes "sintéticas" (calculadas) ( tomografía computarizada , microscopía confocal , SIM y otras técnicas de microscopía de superresolución , etc.).
En vista de lo anterior, el método principal para el análisis de partículas mediante imágenes es la microscopía óptica. Si bien los microscopios ópticos se han utilizado para el análisis de partículas desde el siglo XVII, [ 1 ] el análisis en el pasado se realizaba mediante la observación visual humana . Por lo tanto, gran parte de este análisis es subjetivo o cualitativo. Incluso cuando se dispone de herramientas cualitativas, como una retícula de medición en el microscopio, aún se requiere la intervención humana para determinar y registrar dichas mediciones.
A partir de finales del siglo XIX [ 2 ] , con la disponibilidad de placas fotográficas , fue posible capturar imágenes de microscopio de forma permanente en película o papel, lo que facilitó la obtención de mediciones simplemente utilizando una regla graduada sobre la imagen impresa. Si bien esto aceleró significativamente la obtención de mediciones de partículas, seguía siendo un proceso tedioso y laborioso, lo que no solo dificultaba la medición de poblaciones de partículas estadísticamente significativas, sino que también introducía cierto grado de error humano en el proceso.
Finalmente, a partir de finales de la década de 1970, los sensores digitales CCD para capturar imágenes y las computadoras que podían procesarlas comenzaron a revolucionar el proceso mediante el uso de imágenes digitales . Si bien los algoritmos para realizar el procesamiento de imágenes digitales existían desde hacía algún tiempo, no fue hasta que la potencia de cálculo necesaria para realizar estos análisis estuvo disponible a precios razonables que las técnicas de imágenes digitales pudieron generalizarse. El primer sistema de análisis de partículas de imágenes dinámicas se patentó en 1982. [ 3 ] A medida que se dispuso de recursos informáticos más rápidos a menor costo, la tarea de realizar mediciones a partir de imágenes de partículas de microscopio ahora podía realizarse automáticamente por máquina sin intervención humana, lo que permitió medir un número significativamente mayor de partículas en mucho menos tiempo.
Métodos de adquisición de imágenes
El proceso básico mediante el cual se lleva a cabo el análisis de partículas por imágenes es el siguiente:
- Una cámara digital captura una imagen del campo de visión del sistema óptico.
- Se utiliza un proceso de umbralización en escala de grises para realizar la segmentación de imágenes , separando las partículas del fondo y creando una imagen binaria de cada partícula. [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]
- Se utilizan técnicas de procesamiento de imágenes digitales para realizar operaciones de análisis de imágenes , lo que da como resultado mediciones morfológicas y de escala de grises que se almacenan para cada partícula. [ 7 ]
- Las mediciones guardadas para cada partícula se utilizan para generar estadísticas de población de imágenes [ 8 ] o como entradas para algoritmos que filtran y clasifican las partículas en grupos de tipos similares. En algunos sistemas, también se pueden emplear técnicas sofisticadas de reconocimiento de patrones [ 9 ] [ 10 ] para separar los diferentes tipos de partículas presentes en una muestra heterogénea.
Los analizadores de partículas por imagen se pueden subdividir en dos tipos distintos, estáticos y dinámicos, según los métodos de adquisición de imágenes. Si bien los principios básicos son los mismos, los métodos de adquisición de imágenes son diferentes y cada uno tiene sus ventajas y desventajas.
Análisis de partículas mediante imágenes estáticas
La adquisición de imágenes estáticas es la forma más común. Casi todos los microscopios se pueden adaptar fácilmente para aceptar una cámara digital mediante un adaptador de montura C. Este tipo de configuración se suele denominar microscopio digital , aunque muchos sistemas que utilizan ese nombre se usan únicamente para mostrar una imagen en un monitor .
La muestra se prepara en un portaobjetos que se coloca en la platina del microscopio . Una vez enfocada la muestra, se puede adquirir una imagen y visualizarla en el monitor. Si se dispone de una cámara digital o un capturador de imágenes , la imagen se puede guardar en formato digital y se pueden utilizar algoritmos de procesamiento de imágenes para aislar las partículas en el campo de visión y medirlas. [ 11 ] [ 12 ]
En la adquisición de imágenes estáticas, solo se captura una imagen del campo de visión a la vez. Si el usuario desea obtener imágenes de otras partes de la misma muestra en el portaobjetos, puede utilizar el sistema de posicionamiento XY (generalmente compuesto por dos etapas lineales en el microscopio) para desplazarse a un área diferente del portaobjetos. Es importante asegurarse de que las dos imágenes no se superpongan para evitar contar y medir las mismas partículas más de una vez.
La principal desventaja de la adquisición de imágenes estáticas es que consume mucho tiempo, tanto en la preparación de la muestra (colocarla en el portaobjetos con la dilución adecuada, si es necesario) como en los múltiples movimientos de la platina para poder obtener un número estadísticamente significativo de partículas para contar/medir. En ocasiones, se utilizan platinas de posicionamiento XY controladas por ordenador en estos sistemas para acelerar el proceso y reducir la intervención del operador, pero sigue siendo un proceso laborioso, y las platinas motorizadas pueden resultar caras debido al nivel de precisión requerido al trabajar con gran aumento. [ 13 ]
Las principales ventajas de los sistemas de imagen de partículas estáticas son el uso de microscopios estándar y la simplicidad en el cálculo de la profundidad de campo . Dado que estos sistemas pueden construirse a partir de cualquier microscopio óptico estándar, pueden representar una opción más económica para quienes ya disponen de microscopios. Sin embargo, lo más importante es que los sistemas basados en microscopios suelen presentar menos problemas de profundidad de campo en comparación con los sistemas de imagen dinámicos. Esto se debe a que la muestra se coloca sobre un portaobjetos y, por lo general, se cubre con un cubreobjetos , lo que limita el plano que contiene las partículas con respecto al eje óptico . Esto significa que un mayor número de partículas estarán enfocadas correctamente a grandes aumentos. [ 13 ]
Análisis de partículas mediante imágenes dinámicas
En la adquisición dinámica de imágenes, se obtienen imágenes de grandes cantidades de muestra desplazándola frente a la óptica del microscopio y utilizando iluminación con flash de alta velocidad para "congelar" eficazmente su movimiento. El flash se sincroniza con una alta velocidad de obturación en la cámara para evitar aún más la borrosidad por movimiento. En un sistema de partículas secas, las partículas se dispensan desde una mesa vibratoria y caen por gravedad frente al sistema óptico. En los sistemas de análisis de partículas por imagen de fluidos, el líquido se hace pasar a través del eje óptico mediante una celda de flujo estrecha, como se muestra a la derecha.
La celda de flujo se caracteriza por su profundidad perpendicular al eje óptico, como se muestra en el segundo diagrama de la derecha. Para mantener las partículas enfocadas, la profundidad del flujo se limita de manera que permanezcan en un plano de enfoque óptimo perpendicular al eje óptico. Este concepto es similar al efecto de la lámina portaobjetos y el cubreobjetos en un sistema de imagen estática. Dado que la profundidad de campo disminuye exponencialmente con el aumento de la magnificación, la profundidad de la celda de flujo debe reducirse significativamente a mayores aumentos.
La principal desventaja de la adquisición dinámica de imágenes es que la profundidad de la celda de flujo debe limitarse, como se describió anteriormente. Esto significa que, en general, no se pueden permitir partículas de mayor tamaño que la profundidad de la celda de flujo en la muestra que se está procesando, ya que probablemente obstruirían el sistema. Por lo tanto, normalmente será necesario filtrar la muestra para eliminar las partículas de mayor tamaño que la profundidad de la celda de flujo antes de su evaluación. Si se desea observar un rango muy amplio de tamaños de partículas, esto puede implicar que la muestra deba fraccionarse en componentes de menor tamaño y procesarse con diferentes combinaciones de magnificación y celda de flujo. [ 13 ]
La principal ventaja de la adquisición dinámica de imágenes es que permite adquirir y medir partículas a una velocidad significativamente mayor, generalmente del orden de 10 000 partículas/minuto o más. Esto significa que se pueden analizar poblaciones estadísticamente significativas en periodos de tiempo mucho más cortos que los que eran posibles anteriormente con la microscopía manual o incluso con el análisis de partículas mediante imágenes estáticas. En este sentido, los sistemas de análisis de partículas mediante imágenes dinámicas combinan la velocidad típica de los contadores de partículas con las capacidades discriminatorias de la microscopía. [ 13 ]
El análisis dinámico de partículas mediante imágenes se utiliza en la investigación de microorganismos acuáticos para analizar fitoplancton, zooplancton y otros microorganismos acuáticos con tamaños que oscilan entre 2 µm y 5 mm. Este análisis también se emplea en la investigación biofarmacéutica para caracterizar y analizar partículas con tamaños que van desde 300 nm hasta 5 mm.
Imágenes de microflujo
La microscopía de flujo (MFI) es una técnica de análisis de partículas que utiliza microscopía de flujo para cuantificar las partículas contenidas en una solución según su tamaño. Esta técnica se utiliza en la industria biofarmacéutica para caracterizar partículas subvisibles de aproximadamente 1 μm a >50 μm. [ 14 ]
Referencias
- ↑ Jabez Hogg (1887). El microscopio: su historia, construcción y aplicación: una introducción familiar al uso del instrumento y al estudio de la ciencia microscópica (12.ª ed.). G. Routledge and Sons. pág. 8.
- ↑ Gaston Tissandier (1877). Historia y manual de fotografía . Sampson, Low, Marston, Low y Searle. pág. 1.
- ↑ Patente estadounidense 4,338,024
- ↑ González, Rafael C.; Woods, Richard E. (2002). Procesamiento de imágenes digitales . Pearson Education. págs. 595–611 . ISBN 978-8178086293.
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