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High-performance thin-layer chromatography

Picture of HPTLC plate to identify different substances within a sample. High-performance thin-layer chromatography ( HPTLC ) serves as an extension of thin-layer chromatography...

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Picture of HPTLC plate to identify different substances within a sample.

High-performance thin-layer chromatography (HPTLC) serves as an extension of thin-layer chromatography (TLC), offering robustness, simplicity, speed, and efficiency in the quantitative analysis of compounds.[1] This TLC-based analytical technique enhances compound resolution for quantitative analysis. Some of these improvements involve employing higher-quality TLC plates with finer particle sizes in the stationary phase, leading to improved resolution.[2] Additionally, the separation can be further refined through repeated plate development using a multiple development device. As a result, HPTLC provides superior resolution and lower Limit of Detection (LODs).[3]

Instrumentation

Advantages of HPTLC[1]

  • Provides straightforward information about effects arising from individual compounds in complex or natural samples separated in parallel.
  • Combines chromatographic separation with effect-directed detection using enzymatic or biological assays.
  • Helps to select important compounds from a sample for further characterization using high-resolution mass spectrometry.
  • Offers unique benefits such as super-hyphenation, minimum sample preparation requirements, detection of multi-modulating compounds, and distinguishing agonistic versus antagonistic effects.

Mode

HPTLC comprises three modes: linear mode, circular mode, and anticircular mode. Among these modes, the anticircular mode stands out as the fastest in theory and practice within the realm of HPTLC. This mode achieves separation by allowing the mobile phase to enter the plate layer precisely along an outer circular path, after which it flows toward the center at a nearly constant speed. This approach maximizes sample capacity while minimizing time, layer, and mobile phase consumption, making it the most cost-effective HPTLC technique. The narrow spot-path unique to anticircular HPTLC facilitates automated quantification. When compared to the linear and circular modes, the anticircular mode demonstrates superior separation and significantly heightened sensitivity, especially at higher Rf-values.[2]

Methodology

To begin HPTLC, a stationary phase has to be determined to separate different compounds within a mixture. Around 90% of all pharmaceutical separations are performed on normal phase silica gel; however, other stationary phases such as alumina can be used for samples with dissociating compounds and cellulose for ionic compounds.[4] The reverse-phase HPTLC method (similar methodology to reverse-phase TLC) is used for compounds with high polarity. After the selection of the stationary phase, plates are generally washed with methanol and dried in an oven to remove excess solvent.[5]

Selection for the mobile phase is one of the most important processes of HPTLC and follows a 'trial and error' pathway. However, the 'PRISMA' system stands as a guideline for finding the optimal mobile phase.[1] The mobile phase is dependent on the absorptivity of the stationary phase and the composition of the compound of interest.[5] The compound is first tested with solutions such as diethyl ether, ethanol, dichloromethane, chloroform for normal phase HPTLC, or solutions such as methanol, acetonitrile, and tetrahydrofuran for reverse phase HPTLC. The retardation factors (Rf) of the compounds with the selected solvent are then analyzed and the solvent that gives the largest Rf is chosen to be the mobile phase for the compound. Then, the mobile solvent strength is tested against hexane (for normal HPTLC) and water (for reverse-phase HPTLC) to determine the need for adjustment.[5][6]

CAMAG HPTLC machine

Dispositivos HPTLC notables como el Linomat 5 y el Automatic TLC Sampler 4 (ATS 4) de CAMAG funcionan de manera muy similar al tener la técnica automatizada de aplicación de muestra por "pulverización". [ 4 ] [ 5 ] Esta técnica automatizada de "pulverización" es útil para superar la incertidumbre en el tamaño y la posición de las gotas cuando la muestra se aplica a la placa TLC manualmente. Además, la automatización proporciona alta resolución y bandas estrechas ya que el solvente se evapora inmediatamente cuando la muestra entra en contacto con la placa. [ 4 ] Un enfoque para la automatización ha sido el uso de dispositivos piezoeléctricos e impresoras de inyección de tinta para aplicar la muestra. [ 7 ] Alternativamente, el Nanomat 4 y el ATS 4 de CAMAG se operan manualmente donde la muestra se aplica mediante aplicación puntual usando una pipeta capilar. [ 4 ] [ 5 ]

En la detección cromatográfica, las placas HPTLC se desarrollan generalmente en cámaras de doble cubeta saturadas con papel de filtro para obtener resultados óptimos. [ 5 ] [ 6 ] Sin embargo, también se utilizan cámaras de fondo plano y cámaras de desarrollo horizontal para compuestos específicos. El mecanismo general del dispositivo HPTLC es el siguiente: [ 5 ] Se coloca un papel de filtro ajustado en la cubeta trasera de la cámara y se vierte la fase móvil a través de la cubeta trasera para asegurar la absorción completa del solvente por el papel de filtro. Luego, la cámara se inclina a ~45° para que ambas cubetas tengan el mismo volumen de solvente y se deja equilibrar durante ~20 minutos. [ 5 ] Finalmente, la placa HPTLC se coloca en la cámara para su desarrollo. Entre cada lectura de muestra, se cambian la fase móvil y el papel de filtro para asegurar los mejores resultados.

La capacidad de detección (análoga a la capacidad de pico en HPLC ) puede incrementarse mediante el desarrollo de la placa con dos disolventes diferentes, utilizando cromatografía bidimensional . [ 8 ] El procedimiento comienza con el desarrollo de una placa cargada con la muestra utilizando el primer disolvente. Tras retirarla, la placa se gira 90° y se desarrolla con un segundo disolvente.

Aplicaciones

La HPTLC tiene una amplia aplicación en diversos campos, como la industria farmacéutica, la química clínica, la química forense , la bioquímica, la cosmetología, el análisis de alimentos y medicamentos, el análisis ambiental y muchos más, gracias a sus numerosas ventajas. Se distingue por ser el único método cromatográfico capaz de presentar los resultados en forma de imágenes y ofrece simplicidad, rentabilidad, análisis paralelo de muestras, alta capacidad de análisis, resultados rápidos y la opción de utilizar múltiples métodos de detección.

El equipo de investigación de Le Roux evaluó la HPTLC para determinar los niveles séricos de salbutamol en ensayos clínicos y concluyó que es un método adecuado para analizar muestras de suero. [ 3 ]

La HPTLC ha demostrado ser valiosa en liquenología para el análisis e identificación de sustancias liquénicas . En comparación con la TLC estándar, esta técnica ofrece varias ventajas para el cribado de compuestos liquénicos: permite analizar el doble de muestras en una placa, requiere significativamente menos disolvente (4 ml por placa frente a 250 ml), completa la separación cromatográfica en menos de 10 minutos por placa y puede detectar sustancias a concentraciones mucho más bajas. La mayor sensibilidad del método ha permitido la detección de compuestos liquénicos previamente no identificados y ha revelado una mayor variación química dentro de las especies de líquenes. Desde principios de la década de 1990, la HPTLC se ha utilizado como una alternativa mejorada a la TLC estándar para el cribado rutinario de sustancias liquénicas, aunque el secado adecuado de la placa es fundamental, ya que la técnica es más sensible a la humedad atmosférica que la TLC estándar. [ 9 ]

La HPTLC también se ha utilizado con éxito en la separación de diversas subclases de lípidos, obteniéndose resultados reproducibles y prometedores para 20 subclases diferentes. Se han publicado numerosos informes relacionados con estudios de medicina clínica en diversas revistas. En consecuencia, la HPTLC se recomienda encarecidamente para el análisis de fármacos en suero y otros tejidos. [ 7 ]

Referencias

  1. 1 2 3 Morlock, Gertrud E. (2 de octubre de 2021). "Cromatografía de capa fina de alto rendimiento combinada con ensayos dirigidos por efectos y espectrometría de masas de alta resolución como una tecnología híbrida emergente: una revisión tutorial" . Analytica Chimica Acta . 1180 338644. Bibcode : 2021AcAC.118038644M . doi : 10.1016/j.aca.2021.338644 . ISSN 0003-2670 . PMID 34538319. S2CID 236348479 .   
  2. 1 2 Kaiser, RE (septiembre de 1978). "Cromatografía de capa fina de alto rendimiento anticircular" . Journal of High Resolution Chromatography . 1 (3): 164– 168. doi : 10.1002/jhrc.1240010309 . ISSN 0935-6304 . 
  3. 1 2 Le Roux, AM; Wium, CA; Joubert, JR; Van Jaarsveld, PP (octubre de 1992). "Evaluación de una técnica cromatográfica de capa fina de alto rendimiento para la determinación de los niveles séricos de salbutamol en ensayos clínicos". Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications . 581 (2): 306– 309. doi : 10.1016/0378-4347(92)80288-2 . ISSN 0378-4347 . PMID 1452625 .  
  4. 1 2 3 4 Shewiyo, DH; Kaale, E.; Risha, PG; Dejaegher, B.; Smeyers-Verbeke, J.; Heyden, Y. Vander (1 de julio de 2012). "Métodos HPTLC para analizar ingredientes activos en formulaciones farmacéuticas: una revisión de los pasos de desarrollo y validación del método" . Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis . 66 : 11–23 . doi : 10.1016/j.jpba.2012.03.034 . ISSN 0731-7085 . PMID 22494517 .  
  5. 1 2 3 4 5 6 7 8 Patel, Rashmin B.; Patel, Mrunali R.; Batel, Bharat G. (2011), "Aspectos experimentales e implementación de HPTLC", en Srivastava, ManMohan (ed.), Cromatografía de capa fina de alto rendimiento (HPTLC) , Berlín, Heidelberg: Springer, pp. 41–54 , Bibcode : 2011htc..book...41P , doi : 10.1007/978-3-642-14025-9_3 , ISBN  978-3-642-14025-9
  6. 1 2 Sherma, Joseph (1 de mayo de 2010). "Revisión de HPTLC en el análisis de fármacos: 1996-2009" . Journal of AOAC International . 93 (3): 754– 764. doi : 10.1093/jaoac/93.3.754 . ISSN 1060-3271 . PMID 20629372. Recuperado el 6 de noviembre de 2023 .  
  7. 1 2 Bernardi, Tatiana; Tamburini, Elena (octubre de 2009). "Un método HPTLC-AMD para comprender el comportamiento metabólico de microorganismos en presencia de fuentes mixtas de carbono. El caso de Bifidobacterium adolescenteis MB 239". Revista de cromatografía plana - TLC moderna . 22 (5): 321– 325. doi : 10.1556/jpc.22.2009.5.2 . ISSN 0933-4173 . S2CID 86407898 .  
  8. ↑ Nurok, David (1 de marzo de 1989). "Estrategias para optimizar la fase móvil en cromatografía planar" . Chemical Reviews . 89 (2): 363–375 . doi : 10.1021/cr00092a007 . ISSN 0009-2665 . 
  9. ↑ Arup, Ulf; Ekman, Stefan; Lindblom, Louise; Mattsson, Jan-Eric (1993). "Cromatografía de capa fina de alto rendimiento (HPTLC), una técnica mejorada para el análisis de sustancias liquénicas". The Lichenologist . 25 (1): 61– 71. Bibcode : 1993ThLic..25...61A . doi : 10.1006/lich.1993.1018 .