Ensamblaje Gibson

El ensamblaje de Gibson es un método de clonación molecular que permite la unión de múltiples fragmentos de ADN en una única reacción isotérmica. Recibe su nombre de su creador, Daniel G. Gibson, director de tecnología y cofundador de la empresa de biología sintética Telesis Bio. Esta tecnología es más eficiente que los métodos manuales de recombinación genética de plásmidos , pero sigue siendo costosa, ya que aún está patentada. ^{[ 1 ] [ 2 ]}

La reacción completa del ensamblaje de Gibson requiere pocos componentes y manipulaciones menores. ^{[ 3 ]}

Este método permite combinar simultáneamente hasta 15 fragmentos de ADN según su secuencia. Requiere que los fragmentos de ADN se solapen entre 20 y 40 pares de bases con los fragmentos adyacentes. Estos fragmentos se mezclan con una solución compuesta por tres enzimas y otros componentes del tampón.

Las tres actividades enzimáticas requeridas son: exonucleasa , ADN polimerasa y ADN ligasa .

• La exonucleasa degrada el ADN desde el extremo 5', sin inhibir la actividad de la polimerasa y permitiendo que la reacción ocurra en un solo proceso. ^{[ 3 ]} Las regiones monocatenarias resultantes en fragmentos de ADN adyacentes pueden hibridar.
• La ADN polimerasa incorpora nucleótidos para rellenar cualquier hueco.
• La ADN ligasa une covalentemente el ADN de segmentos adyacentes, eliminando así cualquier rotura en el ADN.

El producto resultante son diferentes fragmentos de ADN unidos en uno solo. Se pueden ensamblar moléculas lineales o circulares cerradas.

Existen dos métodos para el ensamblaje de Gibson: un método de un paso y un método de dos pasos. Ambos métodos pueden realizarse en un único recipiente de reacción. El método de ensamblaje de Gibson de un paso permite ensamblar hasta 5 fragmentos diferentes mediante un proceso isotérmico de un solo paso . En este método, se combinan los fragmentos con una mezcla maestra de enzimas y la mezcla se incuba a 50  °C durante un máximo de una hora. Para la creación de construcciones más complejas con hasta 15 fragmentos, o para construcciones que incorporan fragmentos de 100 pb a 10 kb, se utiliza el método de ensamblaje de Gibson de dos pasos. La reacción de dos pasos requiere dos adiciones separadas de la mezcla maestra. Una de las reacciones corresponde a la etapa de exonucleasa y hibridación, mientras que la otra corresponde a las etapas de ADN polimerasa y ligación. Para el método de dos pasos, se utilizan diferentes temperaturas de incubación para llevar a cabo el proceso de ensamblaje.

El método de ensamblaje de ADN de Gibson tiene muchas ventajas en comparación con la clonación convencional de ADN recombinante mediante enzimas de restricción/ligación. Por ejemplo,

• No es necesario realizar una digestión con enzimas de restricción de los fragmentos de ADN después de la PCR . Sin embargo, el vector base puede ser digerido o sintetizado mediante PCR.
• Es más económico y rápido que los métodos de clonación convencionales, ya que requiere menos pasos y menos reactivos.
• No queda ninguna marca de sitio de restricción entre dos fragmentos de ADN, pero la región entre las hebras dobles y los extremos colgantes es ligeramente susceptible a mutaciones cuando la ADN polimerasa cierra los huecos.
• Se pueden combinar hasta 5 fragmentos de ADN simultáneamente en una reacción en un solo tubo utilizando una mezcla maestra de enzimas de un solo paso.
• Mediante una reacción en dos pasos, se pueden combinar hasta 15 fragmentos simultáneamente. En este método, primero se realizan las etapas de exonucleasa y hibridación. Posteriormente, en una segunda etapa, se añaden la ADN polimerasa y la ligasa .
• El método de ensamblaje de Gibson también se puede utilizar para la mutagénesis dirigida a sitios específicos, con el fin de incorporar mutaciones puntuales, como inserciones, deleciones y mutaciones puntuales.

• La clonación Golden Gate es otro método para clonar múltiples fragmentos de ADN, utilizando enzimas de restricción de tipo IIS.

• Guía para el ensamblaje Gibson de la Universidad de Cambridge, Reino Unido.
• Herramienta de diseño de la guía de montaje Gibson archivada el 30/03/2022 en Wayback Machine .
• Herramienta de diseño de cebadores para mutagénesis dirigida al sitio de ensamblaje de Gibson
• Transformación química de estructuras de ensamblaje de Gibson
• Perkel, Jeffrey M. (enero de 2014). "Reescritura impecable del manual de clonación de laboratorio" . Tech News. BioTechniques . 56 (1): 12– 14. doi : 10.2144/000114121 . PMID 24447134. Gibson dice que ya ni siquiera se molesta con la clonación estándar basada en enzimas de restricción en su laboratorio.