Formazán

Los formazanos son compuestos de la fórmula general [ R−N=N−C(R')=N−NH−R"] , formalmente derivados del formazán [ H ₂ NN−CHN=NH] , desconocido en forma libre. ^{[ 1 ]}

Los colorantes formazán son productos cromogénicos artificiales que se obtienen mediante la reducción de sales de tetrazolio por acción de deshidrogenasas y reductasas . Presentan una variedad de colores que van desde el azul oscuro hasta el rojo intenso y el naranja, dependiendo de la sal de tetrazolio original utilizada como sustrato para la reacción.

Los formazanos son compuestos intensamente coloridos caracterizados por la siguiente estructura: [ −N=N−C(R)=N−NH−] , y están estrechamente relacionados con los colorantes azoicos (−N=N−) . ^{[ 2 ]} Su estructura fue definida por primera vez en 1892, por von Pechmann y por Bamberger y Wheelwright de forma independiente. ^{[ 3 ] [ 4 ]} Su color intenso y su química redox derivan de su esqueleto rico en nitrógeno . ^{[ 5 ]}

Los formazanos poseen una alta flexibilidad tautomérica y conformacional . ^{[ 5 ]} Debido a los dos enlaces dobles alternados en la cadena principal, los formazanos pueden existir en cuatro formas isoméricas posibles: syn, s-cis (forma cerrada); syn, s-trans (forma abierta); anti, s-cis; y anti, s-trans (forma lineal). ^{[ 6 ]}

^Los formazanos 1,5-disustituidos pueden existir como dos tautómeros (1 y 2 en la imagen inferior). Tras ^{la desprotonación} , el anión formado (3) se estabiliza por resonancia . Con iones de metales de transición ( Cu²⁺ , Co³⁺ , ^Ni²⁺ , Zn²⁺ , etc.), los formazanos forman complejos altamente coloreados ( quelatos ).

Debido a su capacidad de reaccionar tanto con ácidos como con bases fuertes, los formazanos pueden considerarse anfóteros . ^{[ 7 ]}

La oxidación de estos compuestos da como resultado su conversión en sales de tetrazolio incoloras. Entre los diversos oxidantes utilizados se encuentran el óxido mercúrico, el ácido nítrico, el nitrito de isoamilo, la N-bromosuccinimida, el permanganato de potasio, el tetraacetato de plomo y el hipoclorito de t-butilo. ^{[ 8 ]} Dependiendo de las condiciones, las sales de tetrazolio pueden reducirse para formar radicales tetrazolilo o formazán:

Existen diversos métodos sintéticos para la síntesis de formazanos. ^{[ 8 ] [ 9 ]}

La reacción de compuestos de diazonio con hidrazonas de aldehído es uno de los procedimientos más comunes para producir formazanos. Las hidrazonas, que son compuestos ricos en electrones, reaccionan con sales de diazonio en un átomo de nitrógeno o de carbono para producir formazanos. Las sales de diazonio se acoplan al nitrógeno amínico de la hidrazona con el desplazamiento de un hidrógeno para dar el intermedio, que luego se reorganiza para formar el formazán. ^{[ 10 ]}

Otra forma de sintetizar formazanos es mediante la reacción de compuestos de metileno activo con sales de diazonio. Las sales de diazonio se adicionan a los compuestos de metileno activo para formar un compuesto azo intermedio, seguido de la adición de una segunda sal de diazonio (en condiciones más alcalinas), lo que produce tetrazeno , que luego forma un formazano 3-sustituido.

Los formazanos también pueden producirse mediante la oxidación de las hidrazidinas correspondientes, generalmente preparadas a través de la reacción de haluros de hidrazonilo con los derivados de hidrazina apropiados . Por ejemplo, el formiato o el ortoformiato de etilo reaccionan con dos equivalentes de fenilhidrazina para producir 1,5-difenilformazán en condiciones ácidas . En condiciones básicas, el nitrato de etilo reacciona en la posición metileno para producir 3-metil-1,5-difenilformazán, que también puede obtenerse a partir de la reacción de fenilazoetano con nitrito de isoamilo .

Además, los formazanos se pueden obtener mediante la descomposición de sales de tetrazolio sustituidas, ya sea fotoquímicamente o bajo la influencia del ácido ascórbico en un medio alcalino . ^{[ 11 ]}

Las sales de tetrazolio y sus productos de formazán se utilizan ampliamente en métodos histoquímicos, especialmente en ensayos de viabilidad colorimétricos . ^{[ 12 ]} Estos procedimientos se basan en la reducción del tetrazolio por enzimas deshidrogenasas mitocondriales, que se transportan dentro de las células vivas:

Entre los ejemplos más destacados de las sales de tetrazolio más utilizadas se incluyen: ^{[ 13 ]}

• INT o cloruro de 2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolio, que es insoluble en agua.
• MTT o bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio, que es insoluble en agua y se utiliza en el ensayo MTT .
• XTT o 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida, que es soluble en agua.
• MTS o 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, que es soluble en agua y se utiliza en el ensayo MTS .
• TTC o cloruro de tetrazolio o cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio, que es soluble en agua.
• La NBT se utiliza en pruebas de diagnóstico, en particular para la enfermedad granulomatosa crónica y otras enfermedades de la función de los fagocitos.

Cuando se reduce en una célula, ya sea enzimáticamente o mediante reacción directa con NADH o NADPH , la sal de tetrazolio clásica, MTT, cambia de color azul a púrpura y puede formar un precipitado insoluble. ^{[ 14 ] [ 15 ]} Estos colorantes de formazán se utilizan comúnmente en ensayos de proliferación y toxicidad celular , como las pruebas EpiDerm y EpiSkin, ya que solo tiñen células vivas y metabólicamente activas. ^{[ 16 ] [ 17 ]}