cultivo por lotes alimentados

Nutrientes como el metanol, el etanol, el ácido acético y los compuestos aromáticos inhiben el crecimiento de los microorganismos incluso a concentraciones relativamente bajas. Al añadir adecuadamente estos sustratos, se puede acortar el tiempo de latencia y reducir notablemente la inhibición del crecimiento celular .

En un cultivo por lotes, para alcanzar concentraciones celulares muy altas, por ejemplo, 50-100 g de células secas/L, se necesitan concentraciones iniciales elevadas de nutrientes en el medio. A concentraciones tan altas, los nutrientes se vuelven inhibidores, aunque no tengan tal efecto a las concentraciones normales utilizadas en cultivos por lotes. La estrategia de cultivo por lotes alimentados se utiliza típicamente en procesos bioindustriales para alcanzar una alta densidad celular en el biorreactor . ^{[ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ]} Generalmente, la solución de alimentación está altamente concentrada para evitar la dilución del biorreactor. La producción de proteínas heterólogas mediante cultivos por lotes alimentados de microorganismos recombinantes ha sido ampliamente estudiada. ^{[ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]}

La adición controlada del nutriente afecta directamente la tasa de crecimiento del cultivo y ayuda a evitar el metabolismo de desbordamiento (formación de metabolitos secundarios, como acetato en Escherichia coli , ácido láctico en cultivos de células de mamíferos, etanol en Saccharomyces cerevisiae ), limitación de oxígeno (anaerobiosis). ^{[ 23 ] [ 24 ]}

En la producción de levadura de panadería a partir de mosto de malta o melaza, se ha reconocido desde principios del siglo XX que se produce etanol incluso en presencia de suficiente oxígeno disuelto (OD) si hay un exceso de azúcar en el medio de cultivo. El etanol es una de las principales causas del bajo rendimiento celular. La formación aeróbica de etanol en presencia de glucosa se conoce como efecto glucosa o efecto Crabtree. Para reducir este efecto, generalmente se emplea un proceso de cultivo por lotes alimentados para la producción de levadura de panadería. En cultivos aeróbicos de Escherichia coli y Bacillus subtilis , se producen ácidos orgánicos como el ácido acético (y en menor cantidad, ácido láctico y ácido fórmico ) como subproductos cuando la concentración de azúcar es alta, y estos ácidos inhiben el crecimiento celular, además de tener un efecto perjudicial sobre las actividades metabólicas. La formación de estos ácidos se denomina efecto Crabtree bacteriano.

Cuando a un microorganismo se le proporciona una fuente de energía de carbono de rápida metabolización, como la glucosa, el consiguiente aumento de la concentración intracelular de ATP conduce a la represión de la biosíntesis de enzimas, lo que provoca una metabolización más lenta de la fuente de energía. Este fenómeno se conoce como represión catabólica. Muchas enzimas, especialmente las implicadas en las vías catabólicas, están sujetas a esta regulación represiva. Un método eficaz para superar la represión catabólica en la biosíntesis de enzimas es el cultivo por lotes alimentados, en el que la concentración de glucosa en el medio de cultivo se mantiene baja, lo que restringe el crecimiento y desreprime la biosíntesis de enzimas. La alimentación lenta de glucosa en la fermentación de penicilina por Penicillium chrysogenum es un ejemplo clásico de esta categoría.

En un proceso microbiano que emplea un mutante auxótrofo (mutante con requerimientos nutricionales), el exceso de suministro del nutriente requerido resulta en un crecimiento celular abundante con escasa acumulación del metabolito deseado debido a la inhibición por retroalimentación y/o la represión del producto final. Sin embargo, la deficiencia del nutriente requerido reduce el crecimiento celular, así como la producción total del metabolito deseado, ya que la tasa de producción suele ser proporcional a la concentración celular. En dicho bioproceso, la acumulación del metabolito deseado puede maximizarse cultivando el mutante con una cantidad limitada del nutriente requerido. Para cultivar el mutante con una baja concentración del nutriente requerido, se añade al cultivo por lotes a una velocidad controlada. Esta técnica se utiliza frecuentemente en la producción industrial de aminoácidos con mutantes auxótrofos. Un ejemplo es la producción de lisina con un mutante de Corynebacterium glutamicum que requiere homoserina o treonina/metionina y que carece del gen de la homoserina deshidrogenasa.

La transcripción de un gen con un promotor reprimible situado aguas arriba del marco de lectura abierto se reprime mediante la combinación del llamado holorrepresor con la región operadora del ADN. Cuando un compuesto químico específico está presente en el medio de cultivo, este compuesto (o su metabolito) en las células se combina como correpresor con un aporrepresor (un tipo de factor de transcripción) para formar el holorrepresor. Mantener la concentración de este compuesto lo más baja posible (sin comprometer el crecimiento celular) permite la expresión continua del gen regulado. El cultivo en modo fed-batch es una técnica eficaz para lograrlo. Ejemplos de promotores reprimibles son el promotor trp y el promotor phoA .

El cultivo por lotes alimentados más sencillo es aquel en el que la velocidad de alimentación del sustrato limitante del crecimiento es constante, es decir, la velocidad de alimentación permanece invariable durante el cultivo. Este caso se muestra en el gráfico (donde el volumen del cultivo es variable).

Este tipo de cultivo por lotes alimentados se denomina cultivo por lotes alimentados constantes (CFBC, por sus siglas en inglés) y está bien establecido matemáticamente ^{[ 25 ]} y experimentalmente ^{[ 26 ]} . En el CFBC, se estudiaron tanto el caso de CFBC de volumen fijo como el de CFBC de volumen variable.

En condiciones ideales, las células crecen exponencialmente. Si la velocidad de alimentación del sustrato limitante del crecimiento se incrementa en proporción a la velocidad de crecimiento exponencial de las células, es posible mantener la velocidad de crecimiento específica de las células durante un largo tiempo mientras se mantiene la concentración del sustrato en el líquido de cultivo a un nivel constante. La velocidad de alimentación requerida (volumétrica o másica) debe incrementarse exponencialmente con el tiempo. Este tipo de operación de alimentación por lotes se denomina cultivo exponencial por lotes alimentados (EFBC); los primeros análisis matemáticos e informes de investigación experimental sobre este método se publicaron en 1974. ^{[ 27 ]} Los orígenes de esta estrategia de alimentación se remontan al cultivo de levadura de panadería, donde la cantidad requerida de melaza se calculaba y añadía en función de la cantidad de biomasa producida durante un intervalo de tiempo específico. Este método es particularmente adecuado para obtener la máxima biomasa posible en el menor tiempo cuando se utilizan sustratos, como el metanol, que presentan una fase de latencia prolongada y una velocidad de crecimiento reducida a altas concentraciones. En general, para maximizar la producción de sustancias intracelulares en el menor tiempo posible, es necesario realizar la EFBC a una tasa de crecimiento cercana a la tasa de crecimiento específica máxima para aumentar la concentración celular final tanto como sea posible.

La limitación de sustrato ofrece la posibilidad de controlar las velocidades de reacción para evitar limitaciones tecnológicas relacionadas con el enfriamiento del reactor y la transferencia de oxígeno. La limitación de sustrato también permite el control metabólico, para evitar efectos osmóticos, represión catabólica y metabolismo excesivo de subproductos. ^{[ 28 ] [ 29 ]}

Si bien los dos métodos de cultivo por lotes alimentados mencionados anteriormente son importantes como enfoques fundamentales, la tasa de alimentación debe variarse de manera óptima según el objetivo específico al producir metabolitos extracelulares. El cultivo por lotes alimentados optimizado de esta manera se denomina cultivo por lotes alimentados optimizado (o fermentación por lotes alimentados optimizada). Aunque varios estudios de investigación han abordado este tipo de método de cultivo por lotes alimentados, ^{[ 30 ] [ 31 ] [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]} la información sobre su implementación industrial sigue siendo limitada. La referencia [32] demuestra que cuando la tasa de producción específica de un metabolito objetivo se expresa como una función de la tasa de crecimiento específica del microorganismo, la solución óptima para la tasa de crecimiento específica se puede obtener basándose en el Principio del Máximo de Pontryagin, utilizando el rendimiento máximo o la productividad máxima como función objetivo; posteriormente, se puede derivar el perfil temporal óptimo de la tasa de alimentación.

Este método implica la medición continua o intermitente de la concentración del sustrato alimentado dentro del caldo de cultivo para usarlo como indicador de control. Se informó un cultivo de lote alimentado controlado automáticamente por retroalimentación directa de la levadura Pichia farinosa IFO 0602 usando etanol como fuente de carbono-energía. ^{[ 35 ]} Se utilizó un sensor de tubo de membrana de teflón microporoso para medir continuamente el etanol disuelto en el caldo de cultivo. Si un sustrato es volátil y su presión parcial en el gas de escape está en equilibrio con su concentración en el líquido, la presión parcial del gas inmediatamente después de salir del caldo puede servir como indicador de control. Las sales de amonio, como el sulfato de amonio, se usan comúnmente como fuentes de nitrógeno inorgánico. Sin embargo, las altas concentraciones de iones de amonio inhiben el crecimiento de células microbianas y animales, reducen la actividad metabólica y suprimen la biosíntesis de enzimas. Para evitar estos efectos, es deseable alimentar la fuente de nitrógeno para mantener una baja concentración de iones amonio, [NH₄⁺ ^] _. En solución acuosa, existe un equilibrio entre [NH₄⁺ ^] _y amoníaco ([NH₃ _] ); a pH 7 o inferior, casi todo existe como [NH₄⁺ _] , mientras que a pH 11 o superior, existe casi en su totalidad como [NH₃ ^{] . Aprovechando esto, los investigadores estudiaron un sistema} _de control de retroalimentación cuasi-directo donde se muestrea continuamente una pequeña cantidad de caldo de cultivo y se conduce a un recipiente sellado (a pH 11,0–11,5) equipado con un electrodo de gas amoníaco. La concentración se mide como [NH₃ _] para mantener un nivel constante de [NH₄⁺ ^] _en el cultivo. ^{[ 36 ] [ 37 ] [ 38 ]} Este control de retroalimentación directa de [NH₄⁺ ^] _se ha aplicado a cultivos de E. coli y levadura con alto rendimiento. ^{[ 39 ]}

Este método utiliza parámetros observables estrechamente relacionados con el proceso como indicadores de control. Los indicadores reportados incluyen oxígeno disuelto (OD), tasa de respiración, presión parcial de CO2 _en el gas de escape, cociente respiratorio (CR), pH, metabolitos, turbidez y fluorescencia. El método de control basado en OD (cultivo por lotes alimentados DO-stat), que utiliza OD, explota el fenómeno en el que el OD aumenta cuando la concentración de sustrato cae por debajo de un valor crítico y disminuye cuando el sustrato supera un cierto nivel. A medida que el cultivo progresa y la concentración celular aumenta, la demanda de oxígeno también aumenta. Por lo tanto, el coeficiente de transferencia de oxígeno volumétrico ( k _L a ) debe aumentarse, ya sea aumentando la tasa de aireación y la velocidad de agitación o suplementando el aire con oxígeno puro para aumentar la fuerza impulsora para mejorar la tasa de transferencia de oxígeno. Históricamente, la alimentación se realizaba a menudo de forma ON/OFF, exponiendo frecuentemente a los microorganismos a estados alternos de semiinanición y suficiencia de sustrato. Estos métodos DO-stat convencionales estaban limitados por valores de OD extremadamente bajos y fluctuaciones significativas. Recientemente, Horiuchi et al. Se demostró experimentalmente que el control PID a niveles más altos de DO (5–40% de saturación de aire) permite el control del punto de ajuste con fluctuaciones mínimas. Los tres parámetros para el control PID se determinaron utilizando el método Ziegler-Nichols. Utilizando este método DO-stat controlado por PID, realizaron con éxito un cultivo por lotes alimentados de 50 horas de E. coli recombinante , logrando una producción de alta concentración (concentración total 2,8–3,0 g/L) de fragmentos variables de cadena simple (scFv) de anticuerpo. ^{[ 40 ]} La presión parcial (concentración) de CO ₂ en el gas de escape se puede monitorear fácilmente utilizando un analizador de gas CO _{2 infrarrojo (sensor de CO 2} industrial de doble haz ), que no presenta riesgo de contaminación para el biorreactor. ^{[ 41 ]} Esto también se aplica a la alimentación de sustratos que inducen cambios de pH, como el ácido acético. Este método de control es particularmente ventajoso cuando se utilizan medios sintéticos compuestos principalmente de sales inorgánicas. Dado que la concentración de CO ₂ en el gas de escape (más precisamente, el producto de la concentración de CO ₂ y el caudal del gas de escape) es generalmente proporcional a la biomasa total en el cultivo, esta variable puede utilizarse para el control automatizado de la alimentación.Se han propuesto métodos de control del cociente respiratorio (CR) que utilizan el CR como indicador de control para la producción de levadura de panadería. Al medir la tasa de evolución del dióxido de carbono y la tasa de consumo de oxígeno, el CR se mantiene en un nivel ligeramente superior a 1,0. Esto mantiene bajas las concentraciones de azúcar y, en consecuencia, reduce la producción de etanol como subproducto. Las presiones parciales de O₂ _y CO₂ _en la entrada y salida del fermentador se miden con precisión y se introducen en un ordenador, que calcula el CR a partir de ecuaciones de balance de masa para controlar la alimentación de melaza. ^{[ 42 ]} El método pH-stat (cultivo por lotes alimentados con pH-stat) utiliza el fenómeno en el que el pH del medio de cultivo se desvía de un punto de ajuste [35][36][37]. ^{[ 43 ] [ 44 ] [ 45 ]} En el control automatizado del pH, se inserta un electrodo de pH en el cultivo y se establecen límites superior e inferior mediante un controlador de pH externo. A medida que los componentes del medio se consumen durante la fermentación, se agrega álcali si el pH cae por debajo del límite inferior, y se agrega ácido si sube por encima del límite superior. Si el cultivo tiende a acidificarse, la alimentación del sustrato se sincroniza con la adición de álcali; si tiende a alcalinizarse, la alimentación se vincula con la adición de ácido. El control de la concentración de metabolitos se utiliza cuando el metabolito es un subproducto cuya producción debe minimizarse, como el etanol en la producción de levadura de panadería. ^{[ 46 ]} En lugar de la medición directa en el caldo de cultivo, se puede medir la concentración de etanol en el gas de escape. El control basado en la turbidez utiliza sensores en línea que miden continuamente la densidad óptica del cultivo (que es casi proporcional a la concentración celular para microorganismos unicelulares). ^{[ 47 ] [ 48 ]} En la fermentación aeróbica, los sensores de turbidez en línea inevitablemente encuentran ruido causado por burbujas de aire. Por lo tanto, se requiere un procesamiento estadístico, como el cálculo secuencial de promedios móviles. ^{[ 49 ]} Independientemente del tipo de control de retroalimentación aplicado, los factores críticos siguen siendo: qué información se introduce en el ordenador, cómo se procesan esos datos y qué software se utiliza para optimizar la alimentación del sustrato. ^{[ 50 ]}