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Articulo de referencia

recombinación de ADN

Las mutaciones puntuales dan lugar a cambios de un solo nucleótido, mientras que las inserciones y deleciones dan lugar a la adición o eliminación de nucleótidos, respectivament...

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Las mutaciones puntuales dan lugar a cambios de un solo nucleótido, mientras que las inserciones y deleciones dan lugar a la adición o eliminación de nucleótidos, respectivamente. [ 1 ] [ 2 ] La recombinación del ADN permite la recombinación de genes parentales, lo que aumenta drásticamente la tasa de evolución dirigida. [ 3 ] La recombinación del ADN es útil para generar proteínas con propiedades novedosas o combinaciones de propiedades deseadas. [ 1 ]

La recombinación de ADN , también conocida como mejoramiento molecular , es un método de recombinación aleatoria in vitro para generar genes mutantes para la evolución dirigida y permitir un rápido aumento en el tamaño de la biblioteca de ADN . [ 1 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] Tres procedimientos para lograr la recombinación de ADN son el mejoramiento molecular que se basa en la recombinación homóloga o la similitud de las secuencias de ADN, las enzimas de restricción que se basan en sitios de restricción comunes y la recombinación aleatoria no homóloga que requiere el uso de horquillas . [ 1 ] En todas estas técnicas, los genes parentales se fragmentan y luego se recombinan. [ 1 ] [ 4 ]

La recombinación de ADN utiliza la recombinación aleatoria en contraposición a la mutagénesis dirigida para generar proteínas con atributos únicos o combinaciones de características deseables codificadas en los genes parentales, como la termoestabilidad y la alta actividad. [ 1 ] [ 8 ] El potencial de la recombinación de ADN para producir proteínas novedosas se ejemplifica en la figura que se muestra a la derecha, la cual demuestra la diferencia entre mutaciones puntuales, inserciones y deleciones, y la recombinación de ADN. [ 1 ] Específicamente, esta figura muestra el uso de la recombinación de ADN en dos genes parentales, lo que permite la generación de proteínas recombinantes que tienen una combinación aleatoria de secuencias de cada gen parental. [ 1 ] Esto es distinto de las mutaciones puntuales en las que se ha cambiado, insertado o eliminado un nucleótido, y de las inserciones o deleciones en las que se ha añadido o eliminado una secuencia de nucleótidos, respectivamente. [ 1 ] [ 2 ] Como resultado de la recombinación aleatoria, la recombinación de ADN puede producir proteínas con nuevas cualidades o múltiples características ventajosas derivadas de los genes parentales. [ 1 ] [ 4 ]

En 1994, Willem PC Stemmer publicó el primer artículo sobre la recombinación de ADN. [ 7 ] Desde la introducción de la técnica, la recombinación de ADN se ha aplicado a productos farmacéuticos de proteínas y moléculas pequeñas , biorremediación , vacunas , terapia génica y virus evolucionados. [ 3 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] Otras técnicas que producen resultados similares a la recombinación de ADN incluyen la quimeragénesis aleatoria en plantillas transitorias (RACHITT), la recombinación in vitro de impresión aleatoria (RPR) y el proceso de extensión escalonada (StEP). [ 4 ] [ 7 ] [ 13 ]

Historia

La recombinación de ADN mediante mejoramiento molecular fue descrita por primera vez en 1994 por Willem PC Stemmer. [ 1 ] [ 7 ] Comenzó fragmentando el gen de la β-lactamasa , amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando DNasa I , que corta el ADN aleatoriamente. [ 14 ] [ 15 ] Posteriormente, realizó una reacción de PCR modificada sin el uso de cebadores , lo que resultó en la hibridación de fragmentos homólogos o con secuencias similares. [ 14 ] Finalmente, estos fragmentos fueron amplificados mediante PCR. [ 14 ] Stemmer informó que el uso de la recombinación de ADN en combinación con el retrocruzamiento resultó en la eliminación de mutaciones no esenciales y un aumento en la producción del antibiótico cefotaxima . [ 14 ] También destacó el potencial de la recombinación de ADN para la evolución molecular . [ 16 ] Específicamente, indicó que la técnica podría utilizarse para modificar proteínas. [ 16 ]

La recombinación de ADN se ha aplicado desde entonces para generar bibliotecas de genes híbridos o quiméricos y ha inspirado la recombinación de familias, que se define como el uso de genes relacionados en la recombinación de ADN. [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] Además, la recombinación de ADN se ha aplicado a productos farmacéuticos de proteínas y moléculas pequeñas, biorremediación, terapia génica, vacunas y virus evolucionados. [ 3 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 20 ]

Procedimientos

Reproducción molecular

Primero, se utiliza la DNasa I para fragmentar un conjunto de genes parentales en segmentos de ADN de doble cadena que varían de 10-50 pb a más de 1 kpb. [ 4 ] [ 16 ] A esto le sigue una PCR sin cebadores. [ 14 ] En la PCR, los fragmentos de ADN con secuencias suficientemente superpuestas se hibridarán entre sí y luego serán extendidos por la ADN polimerasa . [ 1 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 7 ] [ 14 ] [ 16 ] [ 21 ] La extensión de la PCR no ocurrirá a menos que haya secuencias de ADN de alta similitud. [ 1 ] Los factores importantes que influyen en las secuencias sintetizadas en el intercambio de ADN son la ADN polimerasa, las concentraciones de sal y la temperatura de hibridación. [ 10 ] Por ejemplo, el uso de la polimerasa Taq para la amplificación de un fragmento de 1 kbp en una PCR de 20 ciclos da como resultado que entre el 33 % y el 98 % de los productos contengan una o más mutaciones. [ 21 ]

Se pueden utilizar múltiples ciclos de extensión de PCR para amplificar los fragmentos. [ 1 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 7 ] [ 14 ] [ 16 ] [ 21 ] Se añaden cebadores diseñados para ser complementarios a los extremos de los fragmentos extendidos para amplificar aún más las secuencias con otra PCR. [ 1 ] [ 14 ] [ 21 ] Se pueden elegir cebadores para que tengan secuencias adicionales añadidas en sus extremos 5', como secuencias para sitios de reconocimiento de enzimas de restricción que son necesarias para la ligación en un vector de clonación . [ 1 ] [ 14 ]

Es posible recombinar porciones de los genes parentales para generar híbridos o formas quiméricas con propiedades únicas, de ahí el término recombinación de ADN. [ 22 ] La desventaja del mejoramiento molecular es el requisito de similitud entre las secuencias, lo que ha inspirado el desarrollo de otros procedimientos para la recombinación de ADN. [ 1 ]

Enzimas de restricción

Las enzimas de restricción se emplean para fragmentar los genes parentales. [ 1 ] [ 21 ] Los fragmentos se unen luego mediante ligación, que se puede realizar con la ADN ligasa . [ 1 ] Por ejemplo, si dos genes parentales tienen tres sitios de restricción, se pueden crear catorce híbridos genéticos de longitud completa diferentes. [ 1 ] El número de híbridos de longitud completa únicos está determinado por el hecho de que un gen con tres sitios de restricción se puede dividir en cuatro fragmentos . [ 1 ] Por lo tanto, hay dos opciones para cada una de las cuatro posiciones menos las combinaciones que recrearían los dos genes parentales, lo que produce 2 4 - 2 = 14 genes híbridos de longitud completa diferentes . [ 1 ]

La principal diferencia entre la recombinación de ADN con enzimas de restricción y el mejoramiento molecular radica en que este último se basa en la homología de las secuencias para el apareamiento de las hebras y en la PCR para la extensión, mientras que mediante el uso de enzimas de restricción se crean extremos de fragmentos que pueden ligarse. [ 1 ] Las principales ventajas del uso de enzimas de restricción incluyen el control sobre el número de eventos de recombinación y la ausencia de necesidad de amplificación por PCR. [ 1 ] [ 23 ] La principal desventaja es la necesidad de sitios de restricción comunes. [ 1 ]

Recombinación aleatoria no homóloga

Para generar segmentos que van desde 10-50 pb hasta más de 1 kb, se utiliza DNasa I. [ 4 ] [ 16 ] [ 24 ] Los extremos de los fragmentos se vuelven romos añadiendo ADN polimerasa T4. [ 1 ] [ 24 ] El romo de los fragmentos es importante para combinarlos, ya que los extremos cohesivos incompatibles , o salientes, impiden la unión de los extremos. [ 1 ] [ 25 ] [ 26 ] Luego se añaden horquillas con un sitio de restricción específico a la mezcla de fragmentos. [ 1 ] [ 24 ] A continuación, se emplea la ADN ligasa T4 para ligar los fragmentos y formar secuencias extendidas. [ 1 ] [ 24 ] La ligación de las horquillas a los fragmentos limita la longitud de las secuencias extendidas al impedir la adición de más fragmentos. [ 1 ] Finalmente, para eliminar los bucles de horquilla, se utiliza una enzima de restricción. [ 1 ] [ 24 ]

La recombinación aleatoria no homóloga se diferencia del mejoramiento molecular en que la homología de las secuencias ligadas no es necesaria, lo cual es una ventaja. [ 1 ] Sin embargo , debido a que este proceso recombina los fragmentos aleatoriamente, es probable que una gran fracción de las secuencias de ADN recombinadas no tenga las características deseadas, lo cual es una desventaja. [ 1 ] La recombinación aleatoria no homóloga también se diferencia del uso de enzimas de restricción para la recombinación de ADN, ya que no se requieren sitios de restricción comunes en los genes parentales y es necesario el uso de horquillas, lo que demuestra una ventaja y una desventaja de la recombinación aleatoria no homóloga sobre el uso de enzimas de restricción, respectivamente. [ 1 ]

Aplicaciones

Productos farmacéuticos basados ​​en proteínas y moléculas pequeñas

Dado que la recombinación de ADN permite la recombinación de genes, se pueden mejorar las actividades de las proteínas. [ 3 ] [ 20 ] Por ejemplo, la recombinación de ADN se ha utilizado para aumentar la potencia de los interferones recombinantes mostrados en fagos en células murinas y humanas. [ 3 ] Además, la mejora de la proteína verde fluorescente (GFP) se logró con la recombinación de ADN por mejoramiento molecular, obteniéndose una señal 45 veces mayor que el estándar para la fluorescencia de células completas. [ 20 ] Asimismo, la síntesis de diversos genes también puede dar lugar a la producción de proteínas con atributos novedosos. [ 1 ] Por lo tanto, la recombinación de ADN se ha utilizado para desarrollar proteínas que desintoxicen sustancias químicas. [ 3 ] [ 27 ] Por ejemplo, el método de recombinación homóloga de la recombinación de ADN por mejoramiento molecular se ha utilizado para mejorar la desintoxicación de atrazina y arseniato . [ 3 ] [ 27 ]

Biorremediación

La recombinación de ADN también se ha utilizado para mejorar la degradación de contaminantes biológicos. [ 12 ] [ 28 ] Específicamente, se ha creado una cepa recombinante de E. coli mediante la recombinación de ADN por selección molecular para la biorremediación de tricloroetileno (TCE), un carcinógeno potencial , que es menos susceptible a los intermediarios epóxido tóxicos . [ 12 ] [ 21 ] [ 28 ]

Vacunas

La capacidad de seleccionar recombinantes deseables con recombinación de ADN se ha utilizado en combinación con estrategias de cribado para mejorar los candidatos a vacunas contra infecciones, con énfasis en mejorar la inmunogenicidad , la producción de vacunas, la estabilidad y la reactividad cruzada a múltiples cepas de patógenos. [ 3 ] [ 10 ] Se han investigado algunos candidatos a vacunas para Plasmodium falciparum , virus del dengue , alfavirus encefalíticos (incluidos: VEEV , WEEV y EEEV ), virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) y virus de la hepatitis B (VHB). [ 10 ]

Terapia génica y virus evolucionados

Los requisitos para las terapias génicas humanas incluyen alta pureza, alto título y estabilidad. [ 11 ] La recombinación de ADN permite la fabricación de vectores retrovirales con estos atributos. [ 11 ] Por ejemplo, la recombinación de ADN con mejoramiento molecular se aplicó a seis cepas ecotrópicas del virus de la leucemia murina (MLV), lo que resultó en la compilación de una extensa biblioteca de retrovirus recombinantes y la identificación de múltiples clones con mayor estabilidad. [ 11 ] Además, la aplicación de la recombinación de ADN mediante mejoramiento molecular en múltiples vectores de virus adenoasociados (AAV) parentales se empleó para generar una biblioteca de diez millones de quimeras. [ 29 ] Los atributos ventajosos obtenidos incluyen una mayor resistencia a la inmunoglobulina intravenosa humana (IVIG) y la producción de tropismo celular en los nuevos virus. [ 29 ]

Comparación con otras técnicas

Si bien la recombinación de ADN se ha convertido en una técnica útil para la recombinación aleatoria, también se han desarrollado otros métodos, como RACHITT, RPR y StEP, para este propósito. [ 4 ] [ 13 ] A continuación se presentan algunas ventajas y desventajas de estos otros métodos de recombinación. [ 4 ] [ 7 ] [ 13 ]

Rachitt

En RACHITT, los fragmentos de genes parentales monocatenarios (ss) se hibridan sobre una plantilla ss, lo que reduce el desajuste, una ventaja. [ 13 ] Además, RACHITT permite la recombinación de genes con baja similitud de secuencia. [ 7 ] Sin embargo, una desventaja importante es la preparación de los fragmentos ss de los genes parentales y la plantilla ss. [ 7 ] [ 13 ]

RPR

La RPR utiliza cebadores aleatorios. [ 30 ] Estos cebadores aleatorios se hibridan con el ADN molde y luego se extienden mediante el fragmento de Klenow . [ 30 ] A continuación, se eliminan los moldes y los fragmentos se ensamblan por homología en un proceso similar a la PCR. [ 30 ] Algunas ventajas importantes incluyen la menor necesidad de genes parentales debido al uso de moldes de cadena simple y una mayor diversidad de secuencias por cebado erróneo e incorporación errónea. [ 7 ] [ 30 ] Una desventaja de la RPR es la preparación del molde. [ 30 ]

Paso

En StEP, se emplean ciclos breves de hibridación de cebadores a una plantilla y extensión por polimerasa para generar secuencias de longitud completa. [ 31 ] [ 32 ] Las principales ventajas de StEP son la simplicidad del método y la ausencia de purificación de fragmentos. [ 7 ] [ 13 ] Las desventajas de StEP incluyen que consume mucho tiempo y requiere homología de secuencia. [ 7 ] [ 13 ]

Véase también

Referencias

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