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Interferencia de ARN dirigida por ADN

La interferencia de ARN dirigida por ADN (ddRNAi) es una técnica de silenciamiento génico que utiliza construcciones de ADN para activar las vías endógenas de interferencia de A...

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La interferencia de ARN dirigida por ADN (ddRNAi) es una técnica de silenciamiento génico que utiliza construcciones de ADN para activar las vías endógenas de interferencia de ARN (ARNi) de una célula. Las construcciones de ADN están diseñadas para expresar ARN bicatenarios autocomplementarios , típicamente ARN de horquilla corta (shRNA), que provocan el silenciamiento de uno o varios genes diana una vez procesados. [ 1 ] Cualquier ARN , incluidos los ARN mensajeros endógenos (ARNm) o los ARN virales , puede silenciarse diseñando construcciones que expresen ARN bicatenario complementario al ARNm diana deseado .

Se ha demostrado recientemente que este mecanismo funciona terapéuticamente para silenciar genes causantes de enfermedades en una variedad de modelos de enfermedades, incluidas enfermedades virales como el VIH , [ 2 ] la hepatitis B [ 3 ] o la hepatitis C , [ 4 ] y enfermedades asociadas con la expresión alterada de genes endógenos como el cáncer de pulmón resistente a fármacos , [ 5 ] el dolor neuropático , [ 6 ] el cáncer avanzado , [ 7 ] y la retinosis pigmentaria . [ 8 ]

Mecanismo de ddRNAi

A diferencia de los ARN de interferencia pequeños (siRNA), que se renuevan dentro de la célula y silencian genes transitoriamente, las construcciones de ADN se transcriben continuamente, reponiendo el suministro celular de siRNA. Esto permite el silenciamiento a largo plazo de genes específicos, lo que tiene el potencial de brindar un beneficio clínico continuo con una menor intervención médica. [ 2 ] [ 4 ]

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Figura 1: Un constructo de ddRNAi que codifica un shRNA se empaqueta en un vector de administración (o reactivo) diseñado para dirigirse a células específicas. Dentro de la célula, el ADN se transporta al núcleo , donde la maquinaria de transcripción produce continuamente los ARN codificados. Las moléculas de shRNA son procesadas por sistemas endógenos antes de entrar en la vía de RNAi y silenciar los genes deseados. [ 1 ]

Organización de construcciones de ddRNAi

La Figura 1 ilustra el tipo más común de construcción de ADN ddRNAi diseñada para expresar un shRNA. Esta figura consta de una secuencia promotora que dirige la expresión de secuencias sentido y antisentido separadas por una secuencia de bucle, seguida de un terminador transcripcional . La secuencia antisentido procesada a partir del shRNA puede unirse al ARN diana y especificar su degradación. Las construcciones de shRNA suelen codificar secuencias sentido y antisentido de 20 a 30 nucleótidos . Es posible cierta flexibilidad en el diseño de la construcción; por ejemplo, se pueden invertir las posiciones de las secuencias sentido y antisentido, y otras modificaciones y adiciones pueden alterar el procesamiento intracelular del shRNA. [ 9 ] Además, se puede utilizar una variedad de secuencias de bucle promotor y terminador. [ 4 ]

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Figura 2: Construcciones de ADN ddRNAi

Una variante de esto es el multicassette (Figura 2b). Diseñado para expresar dos o más shRNA, puede dirigirse a múltiples secuencias para su degradación simultáneamente, lo que puede ser beneficioso en circunstancias como cuando se atacan virus. Las variaciones naturales de la secuencia pueden hacer que un único sitio diana de shRNA sea irreconocible, impidiendo la degradación del ARN. Las construcciones multicassette que se dirigen a múltiples sitios dentro del mismo ARN viral evitan este problema. [ 4 ]

Entrega

La administración de construcciones de ADN de ddRNAi representa un desafío importante para la terapia basada en ARN de interferencia (ARNi). Existen diversos vectores de terapia génica aprobados clínicamente y desarrollados para uso terapéutico. Se dispone de dos estrategias generales para facilitar la administración de construcciones de ADN a las células deseadas: el uso de vectores virales o de diversos tipos de reactivos de transfección .

Se ha demostrado la administración in vivo de construcciones de ddRNAi utilizando una variedad de vectores y reactivos con diferentes vías de administración (ROA). [ 3 ] [ 4 ] [ 6 ] [ 8 ] Las construcciones de ddRNAi también se han administrado con éxito en células huésped ex vivo y luego se han trasplantado de nuevo al huésped. [ 2 ] [ 7 ] [ 10 ]

Por ejemplo, en un ensayo clínico de fase I en el City of Hope National Medical Center , California, cuatro pacientes VIH positivos con linfoma no Hodgkin fueron tratados con éxito con células progenitoras hematopoyéticas autólogas pretransducidas ex vivo con construcciones de ddRNAi utilizando vectores lentivirales . Esta construcción fue diseñada para expresar tres ARN terapéuticos, uno de los cuales era un shRNA, combatiendo así la replicación del VIH de tres maneras diferentes: [ 2 ]

  • shRNA, que silencia los genes tat y rev del genoma del VIH;
  • Ribozima CCR5, que inhibe la entrada del virus en la célula;
  • ARN señuelo TAR, que inhibe el inicio de la transcripción viral.

Se ha confirmado la expresión continua del shRNA en células T , monocitos y células B más de un año después del trasplante. [ 2 ]

Aplicaciones terapéuticas

dolor neuropático

Nervana es un constructo V en fase de investigación que reduce la expresión de la proteína quinasa C gamma (PKCγ), conocida por estar asociada con el dolor neuropático y la tolerancia a la morfina . [ 6 ]

Se han identificado dos secuencias conservadas de PKCγ en todas las especies modelo clave y en humanos, y se han diseñado casetes de ADN tanto simples como dobles. In vitro , la expresión de PKCγ se silenció en un 80 %. Cuando se administraron construcciones de ddRNAi similares por vía intratecal mediante un vector lentiviral, se demostró el alivio del dolor en un modelo de rata neuropática. [ 6 ]

Cáncer de pulmón de células no pequeñas resistente a los fármacos

El desarrollo de resistencia a quimioterapias como el paclitaxel y el cisplatino en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) está fuertemente asociado con la sobreexpresión de la tubulina beta III . Investigaciones realizadas por el Children's Cancer Institute Australia ( Universidad de Nueva Gales del Sur, Lowy Cancer Research Centre ) demostraron que la inhibición de la tubulina beta III mediante ddRNAi retrasó el crecimiento tumoral y aumentó la quimiosensibilidad en modelos de ratón. [ 5 ]

Tributarna es un casete de ADN triple que expresa tres moléculas de shRNA, cada una de las cuales se dirige por separado a la tubulina beta III e inhibe fuertemente su expresión. Actualmente se están realizando estudios en un modelo ortotópico de ratón, donde el constructo se administra mediante un vector de polietilenimina modificado , jetPEI, que se dirige al tejido pulmonar.

infección por el virus de la hepatitis B

El genoma del virus de la hepatitis B (VHB) codifica su propia ADN polimerasa para la replicación. Biomics Biotechnologies ha evaluado alrededor de 5000 secuencias de ARNip de este gen para lograr una supresión génica efectiva; se seleccionaron cinco secuencias para una investigación más profunda y se demostró que presentaban actividad silenciadora al ser convertidas en casetes de expresión de ARNsh. Un constructo multicasete, Hepbarna, se encuentra en desarrollo preclínico para su administración mediante un vector de virus adenoasociado 8 (AAV-8) dirigido al hígado.

distrofia muscular oculofaríngea

Clasificada como enfermedad rara , actualmente no existe terapia para la distrofia muscular oculofaríngea (OPMD), ya que es causada por una mutación en el gen de la proteína nuclear 1 de unión a poli(A) (PABPN1). El silenciamiento del gen mutante mediante ddRNAi ofrece un posible enfoque terapéutico. [ 11 ]

VIH/SIDA

Además del enfoque ex vivo mencionado anteriormente, el Centro de Infección e Inmunidad de Ámsterdam (CINIMA) de la Universidad de Ámsterdam , Países Bajos, está investigando exhaustivamente el potencial terapéutico de las construcciones de ADN de múltiples casetes para el VIH. [ 12 ]

Preocupaciones

Como ocurre con todas las terapias génicas , durante el desarrollo de las técnicas terapéuticas de ddRNAi deben evaluarse diversas cuestiones de seguridad y toxicidad.

Activación de oncogenes por inserción viral

Algunos vectores de terapia génica se integran en el genoma del huésped, actuando así como mutágenos de inserción . Este fue un problema particular con los primeros vectores retrovirales , donde las inserciones adyacentes a oncogenes dieron lugar al desarrollo de tumores linfoides . [ 13 ]

Los vectores de virus adenoasociados (AAV) se consideran de bajo riesgo de integración en el genoma del huésped, ya que la infección por AAV no se ha asociado con la inducción de cánceres en humanos a pesar de su amplia prevalencia en la población general. Además, el uso clínico extensivo de vectores AAV no ha proporcionado evidencia de carcinogenicidad . Si bien los vectores lentivirales se integran en el genoma, no parecen mostrar propensión a activar la expresión de oncogenes. [ 14 ]

Respuesta inmunitaria a los vectores de terapia génica

En un ensayo clínico inicial, una respuesta inmunológica a un vector adenoviral provocó la muerte de un paciente. El seguimiento riguroso de las posibles toxicidades en las pruebas preclínicas y el análisis de cualquier anticuerpo preexistente contra los vectores de terapia génica en los pacientes minimizan dichos riesgos.

respuesta inmune innata

Se ha demostrado que los siRNA activan las respuestas inmunitarias mediante la interacción con los receptores tipo Toll (TLR), lo que da lugar a respuestas de interferón . Estos TLR se encuentran en la superficie externa de la célula, por lo que no se espera que los constructos de ddRNAi, que se administran directamente en el espacio intracelular, induzcan dicha respuesta. [ 15 ]

Efectos tóxicos debidos a la sobreexpresión de shRNAs

Se ha demostrado que la expresión elevada de shRNA es tóxica. Las estrategias para minimizar los niveles de expresión de shRNA [ 4 ] o promover el procesamiento preciso de shRNA [ 16 ] pueden mitigar este problema.

Efectos fuera del objetivo

Teóricamente, podría producirse el silenciamiento involuntario de genes que comparten homología de secuencia con los shRNA expresados. [ 17 ] Una selección cuidadosa de las secuencias de shRNA y pruebas preclínicas exhaustivas de los constructos pueden mitigar este riesgo.

Lecturas adicionales

  • Rice, RR; Muirhead, AN; Harrison, BT; Kassianos, AJ; Sedlak, PL; Maugeri, NJ; Goss, PJ; Davey, JR; James, DE; Graham, MW (2005). «Estrategias sencillas y robustas para generar construcciones de interferencia de ARN dirigidas por ADN». Interferencia de ARN . Métodos en enzimología. Vol.  392. págs. 405–419 . doi : 10.1016/S0076-6879(04)92024-1 . ISBN  978-0-12-182797-7. PMID 15644195 . 
  • Liu, YP; Westerink, JT; Brake, O.; Berkhout, B. (2011). "Vectores lentivirales inductores de ARN de interferencia para la terapia génica contra el VIH-1". Antiviral RNAi . Methods in Molecular Biology. Vol.  721. pp. 293–311 . doi : 10.1007/978-1-61779-037-9_18 . ISBN  978-1-61779-036-2. PMID 21431693 . 

Referencias

  1. 1 2 Lambeth, LS; Smith, CA (2013). "Silenciamiento génico mediado por ARN de horquilla corta". Diseño de siRNA . Métodos en biología molecular. Vol. 942. págs. 205–232 . doi : 10.1007/978-1-62703-119-6_12 . ISBN   978-1-62703-118-9. PMID 23027054 . 
  2. 1 2 3 4 5 Digiusto, DL; Krishnan, A.; Li, L.; Li, H.; Li, S.; Rao, A.; Mi, S.; Yam, P.; Stinson, S.; Kalos, M.; Alvarnas, J.; Lacey, SF; Yee, J. -K.; Li, M.; Couture, L.; Hsu, D.; Forman, SJ; Rossi, JJ; Zaia, JA (2010). "Terapia génica basada en ARN para el VIH con células CD34+ modificadas con vector lentiviral en pacientes sometidos a trasplante por linfoma relacionado con el SIDA" . Science Translational Medicine . 2 (36): 36ra43. doi : 10.1126/scitranslmed.3000931 . PMC 3130552. PMID 20555022 .  
  3. 1 2 Chen, C. -C.; Chang, C. -M.; Sun, C. -P.; Yu, C. -P.; Wu, P. -Y.; Jeng, K. -S.; Hu, C. -P.; Chen, P. -J.; Wu, J. -C.; Shih, CH; Gershwin, ME; Tao, M. -H. (2011). "Uso de la interferencia de ARN para modular el desarrollo de adenomas hepáticos en un modelo murino transgénico para el virus de la hepatitis B" . Gene Therapy . 19 (1): 25– 33. doi : 10.1038/gt.2011.60 . PMID 21562593 . 
  4. 1 2 3 4 5 6 Suhy, DA; Kao, SC; Mao, T.; Whiteley, L.; Denise, H.; Souberbielle, B.; Burdick, AD; Hayes, K.; Wright, JF; Lavender, H.; Roelvink, P.; Kolykhalov, A.; Brady, K.; Moschos, SA; Hauck, B.; Zelenaia, O.; Zhou, S.; Scribner, C.; High, KA; Renison, SH; Corbau, R. (2012). "Expresión hepática segura y a largo plazo de shRNA anti-VHC en un modelo de primate no humano" . Molecular Therapy . 20 (9): 1737– 1749. doi : 10.1038/mt.2012.119 . PMC 3437581 . PMID 22735378 .  
  5. 1 2 McCarroll, JA; Gan, PP; Liu, M.; Kavallaris, M. (2010). "III-Tubulina es una proteína multifuncional involucrada en la sensibilidad a fármacos y la tumorigénesis en el cáncer de pulmón de células no pequeñas" . Cancer Research . 70 (12): 4995– 5003. doi : 10.1158/0008-5472.CAN-09-4487 . PMID 20501838 . 
  6. 1 2 3 4 Zou, W.; Song, Z.; Guo, Q.; Liu, C.; Zhang, Z.; Zhang, Y. (2011). "La interferencia de ARN mediada por lentivirus intratecal dirigida a PKCγ atenúa el dolor neuropático inducido por lesión por constricción crónica en ratas". Human Gene Therapy . 22 (4): 465– 475. doi : 10.1089/hum.2010.207 . PMID 21087146 . 
  7. ^ Senzer , N.; Barve, M.; Kuhn, J.; Melnyk, A.; Beitsch, P.; Lazar, M.; Lifshitz, S.; Magee, M.; Ah, J.; Molino, suroeste; Bedell, C.; Higgs, C.; Kumar, P.; Yu, Y.; Norvell, F.; Phalon, C.; Taquet, N.; Rao, DD; Wang, Z.; Jay, CM; Pappen, BO; Wallraven, G.; Brunicardi, FC; Shanahan, DM; Arces, PB; Nemunaitis, J. (2011). "Ensayo de fase I de la vacuna" bi-shRNAifurin / ADN GMCSF / células tumorales autólogas "(FANG) en cáncer avanzado" . Terapia Molecular . 20 (3): 679– 686. doi : 10.1038/mt.2011.269 . PMC 3293620 . PMID 22186789 .  
  8. 1 2 Millington-Ward, S.; Chadderton, N.; O'Reilly, M.; Palfi, A.; Goldmann, T.; Kilty, C.; Humphries, M.; Wolfrum, U.; Bennett, J.; Humphries, P.; Kenna, PF; Farrar, GJ (2011). " Terapia génica de supresión y reemplazo para la enfermedad autosómica dominante en un modelo murino de retinosis pigmentaria dominante" . Molecular Therapy . 19 (4): 642– 649. doi : 10.1038/mt.2010.293 . PMC 3070095. PMID 21224835 .  
  9. ↑ Gu, S.; Jin, L.; Zhang, Y.; Huang, Y.; Zhang, F.; Valdmanis, PN; Kay, MA (2012). "La posición del bucle de los shRNA y pre-miRNA es crítica para la precisión del procesamiento de Dicer in vivo" . Cell . 151 ( 4): 900–911 . doi : 10.1016/j.cell.2012.09.042 . PMC 3499986. PMID 23141545 .  
  10. ↑ Ringpis, GEE; Shimizu, S.; Arokium, H.; Camba-Colón, J.; Carroll, MV; Cortado, R.; Xie, Y.; Kim, PY; Sahakyan, A.; Lowe, EL; Narukawa, M.; Kandarian, FN; Burke, BP; Symonds, GP; An, DS; Chen, IS; Kamata, M. (2012). Speck, Roberto F (ed.). "Ingeniería de células T resistentes al VIH-1 a partir de células madre/progenitoras hematopoyéticas que expresan ARN de horquilla corta en ratones BLT humanizados" . PLOS ONE . 7 (12) e53492. Bibcode : 2012PLoSO...753492R . doi : 10.1371/journal.pone.0053492 . PMC 3534037 . PMID 23300932 .  
  11. ↑ Trollet, C.; Anvar, SY; Venema, A.; Hargreaves, IP; Foster, K.; Vignaud, A.; Ferry, A.; Negroni, E.; Hourde, C.; Baraibar, MA; "t" hoen, PAC; Davies, JE; Rubinsztein, DC; Heales, SJ; Mouly, V.; Van Der Maarel, SM; Butler-Browne, G.; Raz, V.; Dickson, G. (2010). "Caracterización molecular y fenotípica de un modelo de ratón de distrofia muscular oculofaríngea revela atrofia muscular severa restringida a fibras glucolíticas rápidas" . Human Molecular Genetics . 19 (11): 2191– 2207. doi : 10.1093/hmg/ddq098 . PMID 20207626 . 
  12. ↑ Brake, OT; Hooft, K. 'T.; Liu, YP; Centlivre, M.; Jasmijn Von Eije, K.; Berkhout, B. (2008). "Diseño de vector lentiviral para la expresión de shRNA múltiple e inhibición duradera del VIH-1" . Molecular Therapy . 16 (3): 557– 564. doi : 10.1038/sj.mt.6300382 . PMC 7172400. PMID 18180777 .  
  13. ↑ Woods, NB; Bottero, V.; Schmidt, M.; Von Kalle, C.; Verma, IM (2006). " Terapia génica: gen terapéutico causante de linfoma" . Nature . 440 (7088): 1123. Bibcode : 2006Natur.440.1123W . doi : 10.1038/4401123a . PMID 16641981. S2CID 4372110 .  
  14. ↑ Wang, GP; Levine, BL; Binder, GK; Berry, CC; Malani, N.; McGarrity, G.; Tebas, P.; June, CH; Bushman, FD (2009). "Análisis de la integración del vector lentiviral en sujetos de estudio VIH+ que reciben infusiones autólogas de células T CD4+ modificadas genéticamente" . Terapia molecular . 17 (5): 844– 850. doi : 10.1038/mt.2009.16 . PMC 2835137. PMID 19259065 .  
  15. ^ Kleinman, ME; Yamada, K.; Takeda, A.; Chandrasekaran, V.; Nozaki, M.; Baffi, JZ; Alburquerque, RJC; Yamasaki, S.; Itaya, M.; Pan, Y.; Appukuttan, B.; Gibbs, D.; Yang, Z.; Karikó, K.; Ambati, BK; Wilgus, TA; Dipietro, LA; Sakurai, E.; Zhang, K.; Smith, JR; Taylor, EW; Ambati, J. (2008). "Supresión de la angiogénesis independiente de la secuencia y el objetivo mediante ARNip a través de TLR3" . Naturaleza . 452 (7187): 591– 597. Bibcode : 2008Natur.452..591K . doi : 10.1038/naturaleza06765 . PMC 2642938 . PMID 18368052 .  
  16. ↑ McBride, JL; Boudreau, RL; Harper, SQ; Staber, PD; Monteys, AM; Martins, I.; Gilmore, BL; Burstein, H.; Peluso, RW; Polisky, B.; Carter, BJ; Davidson, BL (2008). "Los miRNA artificiales mitigan la toxicidad mediada por shRNA en el cerebro: Implicaciones para el desarrollo terapéutico de RNAi" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 105 ( 15): 5868– 5873. Bibcode : 2008PNAS..105.5868M . doi : 10.1073/pnas.0801775105 . PMC 2311380. PMID 18398004 .  
  17. ↑ Jackson, AL; Bartz, SR; Schelter, J.; Kobayashi, SV; Burchard, J.; Mao, M.; Li, B.; Cavet, G.; Linsley, PS (2003). "El perfil de expresión revela la regulación génica fuera de objetivo por ARN de interferencia". Nature Biotechnology . 21 (6): 635– 637. doi : 10.1038/nbt831 . PMID 12754523 . S2CID 24778534 .