Cósmido

Un cósmido es un tipo de plásmido híbrido que contiene una secuencia cos del fago Lambda . ^{[ 1 ]} Los cósmidos, a menudo utilizados como vectores de clonación en ingeniería genética , pueden emplearse para construir bibliotecas genómicas . Fueron descritos por primera vez por Collins y Hohn en 1978. ^{[ 2 ]} Los cósmidos pueden contener de 37 a 52 (normalmente 45) kb de ADN, límites basados ​​en el tamaño normal de empaquetamiento del bacteriófago. Pueden replicarse como plásmidos si poseen un origen de replicación (ori) adecuado: por ejemplo, el ori SV40 en células de mamíferos, el ori ColE1 para la replicación de ADN de doble cadena o el ori f1 para la replicación de ADN de cadena simple en procariotas . Con frecuencia también contienen un gen de selección, como la resistencia a antibióticos , de modo que las células transformadas pueden identificarse mediante siembra en un medio que contenga el antibiótico. Aquellas células que no incorporaron el cósmido no podrían crecer. ^{[ 3 ]}

A diferencia de los plásmidos, también pueden empaquetarse in vitro en cápsides de fagos , un paso que requiere extremos cohesivos , también conocidos como sitios cos , que también se utilizan en la clonación con un fago lambda como vector; sin embargo, casi todos los genes lambda se han eliminado con la excepción de la secuencia cos . El ADN cósmido híbrido en las cápsides puede luego transferirse a células bacterianas por transducción . Dado que existe un requisito para el empaquetamiento in vitro, donde se requieren al menos 38 kb de ADN entre los sitios cos, el vector sin ADN insertado no se empaquetará (la inestabilidad de los plásmidos aumenta si el nuevo ADN insertado contiene muchas repeticiones directas o ADN palindrómico (repeticiones invertidas). Esta inestabilidad puede contrarrestarse en gran medida utilizando una bacteria huésped con mutaciones específicas que afectan la recombinación del ADN (NB: La ausencia de repeticiones invertidas se observó en la primera publicación de Hohn y Collins citada anteriormente; véase también ^{[ 4 ]} ).

Las secuencias Cos tienen aproximadamente 200 pares de bases de longitud y son esenciales para el empaquetamiento. Contienen un sitio cosN donde la terminasa corta el ADN en cada hebra, separadas por 12 pares de bases . Esto provoca la linealización del cósmido circular con dos extremos cohesivos o pegajosos de 12 pares de bases. (El ADN debe ser lineal para que quepa en la cabeza del fago). El sitio cosB mantiene unida a la terminasa mientras corta y separa las hebras. El sitio cosQ del siguiente cósmido (ya que la replicación en círculo rodante a menudo produce concatémeros lineales ) es mantenido por la terminasa después de que el cósmido anterior se haya empaquetado, para evitar la degradación por las DNasas celulares .

Los cósmidos son predominantemente plásmidos con un oriV bacteriano , un marcador de selección antibiótica y un sitio de clonación, pero también portan uno, o más recientemente dos, sitios cos derivados del bacteriófago lambda. Dependiendo del objetivo específico del experimento, se dispone de cósmidos de amplio rango de hospedadores, cósmidos lanzadera o cósmidos "mamíferos" (vinculados al oriV del SV40 y marcadores de selección mamíferos). La capacidad de carga de los cósmidos varía según el tamaño del vector, pero suele rondar los 40-45 kb. El procedimiento de clonación implica la generación de dos brazos del vector que luego se unen al ADN extraño. La selección contra el ADN del cósmido de tipo silvestre se realiza simplemente por exclusión de tamaño. Por lo tanto, los cósmidos siempre forman colonias y no placas. Además, la densidad de clones es mucho menor, con alrededor de 10⁵ ^- 10⁶ ^UFC por μg de ADN ligado.

Tras la construcción de bibliotecas de fagos lambda recombinantes o cósmidos, el ADN total se transfiere a una cepa de E. coli huésped adecuada mediante una técnica denominada empaquetamiento in vitro. Los extractos necesarios para el empaquetamiento se obtienen de lisógenos de E. coli cI857 (red-gam-Sam y Dam (ensamblaje de la cabeza) y Eam (ensamblaje de la cola), respectivamente). Estos extractos reconocen y empaquetan las moléculas recombinantes in vitro , generando partículas de fago maduras (vectores basados ​​en lambda) o plásmidos recombinantes contenidos en cápsides de fago (cósmidos). Estas diferencias se reflejan en las distintas frecuencias de infección observadas a favor de los vectores de reemplazo de lambda. Esto compensa su capacidad de carga ligeramente inferior. Las bibliotecas de fagos también se almacenan y analizan con mayor facilidad que las bibliotecas de cósmidos.

ADN diana: el ADN genómico que se va a clonar debe cortarse en fragmentos de restricción del tamaño adecuado. Esto se suele hacer mediante restricción parcial seguida de fraccionamiento por tamaño o desfosforilación (con fosfatasa de intestino de ternera) para evitar la reordenación cromosómica, es decir, la ligación de fragmentos físicamente no ligados.

Entre los vectores de uso común se incluye "SuperCos 1".