Secuenciación de consenso circular

La secuenciación de consenso circular (CCS) es un método de secuenciación de ADN que se utiliza junto con la secuenciación en tiempo real de molécula única para generar conjuntos de datos de secuenciación de lectura larga de alta precisión, con longitudes de lectura promedio de 15 a 25 kb y una precisión media superior al 99,9 %. ^{[ 1 ] [ 2 ]} Estas lecturas largas, que se crean mediante la formación de secuenciación de consenso obtenida a partir de múltiples pasadas en una sola molécula de ADN, pueden utilizarse para mejorar los resultados en aplicaciones complejas como la detección de variantes estructurales y de un solo nucleótido , el ensamblaje del genoma , el ensamblaje de genomas poliploides difíciles o altamente repetitivos y el ensamblaje de metagenomas . ^{[ 3 ]}

CCS permite la resolución de genomas grandes o complejos, como el genoma de la secuoya roja de California , nueve veces mayor que el genoma humano , de cualquier especie, incluyendo la detección de variantes, desde variantes de un solo nucleótido (SNV) hasta variantes estructurales, con alta precisión. ^{[ 4 ] [ 5 ]} CCS también permite la separación de las diferentes copias de cada cromosoma (por ejemplo, materna y paterna para organismos diploides ), conocidas como haplotipos . Las lecturas CCS ofrecen las ventajas de una alta precisión equivalente a los datos de secuenciación de lectura corta , pero con la longitud necesaria para ensamblajes de genomas complejos y la determinación de fases de variantes en todo el genoma. ^{[ 6 ] [ 7 ]}

En este método, fragmentos circularizados de ADN en solución flotan sobre la superficie de un chip nanofluídico llamado celda SMRT (Single Molecule, Real-Time). La superficie del chip está cubierta con millones de pozos llamados guías de onda de modo cero (ZMW), cada uno de unos pocos nanómetros de ancho. ^{[ 8 ]} Para preparar una muestra para la secuenciación CCS/HiFi, se agregan cebadores y ADN polimerasa a las bibliotecas SMRTbell. El ADN circularizado queda atrapado en la ZMW, se agregan nucleótidos y la enzima ADN polimerasa comienza a copiar la molécula base por base. Mientras esto sucede, se libera una pequeña cantidad de luz que es leída por un detector, lo que ayuda a la computadora del secuenciador a determinar el orden de las bases presentes en la muestra. El ADN circularizado se secuencia en pasadas repetidas para garantizar la precisión (de ahí el nombre de secuenciación de consenso "circular"), luego los cebadores y adaptadores se eliminan mediante bioinformática para obtener una lectura de ADN de consenso de alta precisión. ^{[ 9 ]}

En CCS, el ADN genómico se prepara sin amplificación, de modo que las modificaciones de bases individuales, como la metilación, pueden detectarse durante la secuenciación. Esto permite obtener información valiosa tanto sobre la secuencia como sobre la metilación en un solo experimento. ^{[ 10 ]}

Este método de secuenciación fue descrito por primera vez por Travers, KJ, et al. en Nucleic Acids Research en 2010. ^{[ 3 ]} Posteriormente fue comercializado por Pacific Biosciences en 2018 y puesto a disposición en los instrumentos de secuenciación de lectura larga Sequel II y Revio. ^{[ 11 ] [ 12 ]}

La tecnología CCS se ha utilizado posteriormente para impulsar numerosos estudios en varios campos, entre ellos: investigación del genoma humano, de telómero a telómero , de genoma completo y de pangenoma , ^{[ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]} análisis genómico de enfermedades raras pediátricas , ^{[ 16 ] [ 17 ]} comprensión de la metilación del ADN en cohortes de enfermedades raras, ^{[ 18 ]} ensamblaje de genomas completos de vertebrados no humanos, ^{[ 19 ]} ensamblaje de genomas completos de otras especies de importancia agrícola, ^{[ 20 ]} análisis de genomas cancerosos ^{[ 21 ] [ 22 ]} e investigación metagenómica y microbiana, entre otros. ^{[ 23 ] [ 24 ]}

Reconociendo la importancia de esta tecnología en la exploración y el descubrimiento genómicos futuros, los editores de Nature Methods nombraron a la tecnología de secuenciación de lectura larga como su método del año para 2022. ^{[ 25 ]}