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PCR en frío

COLD-PCR ( PCR de coamplificación a baja temperatura de desnaturalización ) es un protocolo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) modificado que enriquece los alelos vari...

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COLD-PCR ( PCR de coamplificación a baja temperatura de desnaturalización ) es un protocolo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) modificado que enriquece los alelos variantes a partir de una mezcla de ADN de tipo silvestre y ADN que contiene mutaciones . La capacidad de amplificar e identificar preferentemente alelos minoritarios y mutaciones somáticas de ADN de bajo nivel en presencia de un exceso de alelos de tipo silvestre es útil para la detección de mutaciones. La detección de mutaciones es importante en el caso de la detección temprana del cáncer a partir de biopsias de tejido y fluidos corporales como plasma sanguíneo o suero , la evaluación de la enfermedad residual después de la cirugía o quimioterapia , la estadificación de la enfermedad y el perfil molecular para el pronóstico o la adaptación de la terapia a pacientes individuales, y el seguimiento del resultado de la terapia y la remisión o recaída del cáncer. La PCR común amplificará tanto los alelos mayoritarios (de tipo silvestre) como los minoritarios (mutantes) con la misma eficiencia, lo que impide la detección sencilla de la presencia de mutaciones de bajo nivel. La capacidad de detectar una mutación en una mezcla de ADN variante/silvestre es valiosa porque esta mezcla de ADN variante puede ocurrir cuando se proporciona una muestra heterogénea, como suele suceder con las biopsias de cáncer. Actualmente, la PCR tradicional se utiliza junto con varios ensayos posteriores para la genotipificación o la detección de mutaciones somáticas . Estos pueden incluir el uso de ADN amplificado para el análisis RFLP , la genotipificación MALDI-TOF (desorción láser asistida por matriz-tiempo de vuelo) o la secuenciación directa para la detección de mutaciones mediante secuenciación Sanger o pirosecuenciación . Reemplazar la PCR tradicional por COLD-PCR para estos ensayos posteriores aumentará la fiabilidad en la detección de mutaciones en muestras mixtas, incluidos tumores y fluidos corporales.

Resumen de métodos

Una visión general de la PCR en frío en comparación con la PCR convencional.
PCR convencional comparada con COLD-PCR.

El principio fundamental de la PCR en frío es que los desajustes de un solo nucleótido alterarán ligeramente la temperatura de fusión (Tm) del ADN de doble cadena. Dependiendo del contexto de la secuencia y la posición del desajuste, son comunes los cambios de Tm de 0,2 a 1,5  °C (0,36 a 2,7  °F) para secuencias de hasta 200 pb o más. Sabiendo esto, los autores del protocolo aprovecharon dos observaciones:

  • Cada ADN de doble cadena tiene una "temperatura crítica" (Tc) inferior a su Tm. La eficiencia de amplificación por PCR disminuye notablemente por debajo de la Tc.
  • La Tc depende de la secuencia de ADN. Dos fragmentos de ADN molde que difieren en solo uno o dos desajustes de nucleótidos tendrán diferentes eficiencias de amplificación si el paso de desnaturalización de la PCR se ajusta a la Tc.

Teniendo en cuenta estos principios, los autores desarrollaron el siguiente protocolo general:

  1. Etapa de desnaturalización. El ADN se desnaturaliza a una temperatura alta , generalmente 94 °C (201 °F) .   
  2. Etapa de hibridación intermedia. Establezca una temperatura de hibridación intermedia que permita la hibridación del ADN del alelo mutante y del alelo silvestre entre sí. Dado que el ADN del alelo mutante constituye la minoría del ADN en la mezcla, será más probable que forme heteroduplex con desajustes con el ADN del alelo silvestre.
  3. Etapa de fusión. Estos heterodúplex se funden más fácilmente a temperaturas más bajas. Por lo tanto, se desnaturalizan selectivamente en la Tc.
  4. Etapa de hibridación de los cebadores. El ADN homoduplex permanecerá preferentemente bicatenario y no estará disponible para la hibridación de los cebadores.
  5. Etapa de extensión. La ADN polimerasa extenderá la secuencia complementaria al ADN molde. Dado que el ADN heteroduplex se utiliza como molde, se amplificará una mayor proporción de ADN variante menor, que estará disponible para rondas posteriores de PCR.

Hasta la fecha se han desarrollado dos formas de COLD-PCR: COLD-PCR completa y COLD-PCR rápida.

Una descripción general de la PCR en frío completa en comparación con la PCR en frío rápida.
PCR en frío completa frente a PCR en frío rápida.

Lleno

La PCR en frío completa es idéntica al protocolo descrito anteriormente. Estas cinco etapas se utilizan para cada ronda de amplificación.

Rápido

La PCR rápida en frío se diferencia de la PCR completa en frío en que se omiten las etapas de desnaturalización y de hibridación intermedia. Esto se debe a que, en algunos casos, la amplificación preferencial del ADN mutante es tan grande que no es necesario asegurar la formación del heterodúplex mutante/silvestre. Por lo tanto, la desnaturalización puede ocurrir a la Tc, seguida de la hibridación de los cebadores y, posteriormente, la extensión mediada por la polimerasa. Cada ronda de amplificación incluirá estas tres etapas en ese orden. Al utilizar una temperatura de desnaturalización más baja, la reacción discriminará hacia los productos con la Tm más baja, es decir, los alelos variantes. La PCR rápida en frío produce resultados mucho más rápidos debido al protocolo acortado, mientras que la PCR completa en frío es esencial para la amplificación de todas las mutaciones posibles en la mezcla inicial de ADN.

La COLD-PCR de dos rondas es una versión modificada de la Fast COLD-PCR. Durante la segunda ronda de la Fast COLD-PCR se utilizan cebadores anidados. Esto mejora la sensibilidad de la detección de mutaciones en comparación con la Fast COLD-PCR de una ronda. [ 1 ]

Usos

La técnica COLD-PCR se ha utilizado para mejorar la fiabilidad de diversos ensayos que tradicionalmente emplean la PCR convencional.

Algunas de las aplicaciones derivadas de la PCR en frío.
Aplicaciones posteriores que utilizan PCR convencional y que pueden sustituirse por COLD-PCR.

RFLP

Un polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción da como resultado la escisión (o ausencia de ella) del ADN para una mutación específica por una enzima de restricción seleccionada que no escinde el ADN de tipo silvestre. En un estudio que utilizó una mezcla de ADN de tipo silvestre y ADN que contenía la mutación, amplificado mediante PCR convencional o COLD-PCR, se demostró que la COLD-PCR previa al análisis RFLP mejoraba la detección de mutaciones entre 10 y 20 veces. [ 2 ]

secuenciación de Sanger

Recientemente se utilizó la secuenciación de Sanger para evaluar el enriquecimiento de ADN mutante a partir de una mezcla de ADN mutante:silvestre en proporción 1:20. El ADN variante que contenía una mutación se obtuvo de una línea celular de cáncer de mama conocida por contener mutaciones en p53 . [ 1 ] La comparación de los cromatogramas de secuenciación de Sanger indicó que el alelo mutante se enriqueció 13 veces cuando se utilizó COLD-PCR en comparación con la PCR tradicional sola. [ 1 ] Esto se determinó por el tamaño de los picos en el cromatograma en la ubicación del alelo variante.

Asimismo, se utilizó COLD-PCR para detectar mutaciones del gen p53 en muestras de adenocarcinoma de pulmón . El estudio logró detectar ocho mutaciones de bajo nivel (con una abundancia inferior al 20%) que probablemente habrían pasado desapercibidas con los métodos convencionales, que no enriquecen el ADN con secuencias variantes.

pirosecuenciación

De forma similar a su uso en la secuenciación directa de Sanger, se demostró que la COLD-PCR con pirosecuenciación era capaz de detectar mutaciones con una prevalencia del 0,5 al 1 % en las muestras utilizadas. [ 3 ] La COLD-PCR se utilizó para detectar mutaciones de p53 y KRAS mediante pirosecuenciación, y se demostró que superaba a la PCR convencional en ambos casos.

MALDI-TOF

El mismo grupo de investigación que desarrolló COLD-PCR y la utilizó para comparar la sensibilidad de la PCR convencional para la genotipificación con la secuenciación directa de Sanger, RFLP y pirosecuenciación, también realizó un estudio similar utilizando MALDI-TOF como aplicación posterior para la detección de mutaciones. Sus resultados indicaron que COLD-PCR podía enriquecer las secuencias de mutaciones de una mezcla de ADN entre 10 y 100 veces y que las mutaciones con una prevalencia inicial del 0,1 al 0,5 % serían detectables. [ 4 ] En comparación con la tasa de detección de bajo nivel del 5 al 10 % esperada con la PCR tradicional.

PCR cuantitativa

Se demostró que la PCR en frío realizada en una máquina de PCR cuantitativa , utilizando sondas TaqMan específicas para una mutación, aumenta la diferencia medida entre las muestras mutantes y de tipo silvestre. [ 4 ]

Ventajas

  • Método de un solo paso capaz de enriquecer tanto alelos minoritarios conocidos como desconocidos, independientemente del tipo y la posición de la mutación.
  • No requiere reactivos costosos ni maquinaria especializada.
  • Mejor que la PCR convencional para la detección de mutaciones en una muestra mixta.
  • No aumenta significativamente el tiempo de ejecución del experimento en comparación con la PCR convencional.

Desventajas

  • Se debe medir y determinar el valor óptimo de Tc para cada amplicón, lo que añade un paso adicional a los procedimientos convencionales basados ​​en PCR.
  • Se requiere un control preciso de la temperatura de desnaturalización durante la PCR con una tolerancia de ± 0,3  °C (0,54  °F).
  • Es posible que no se disponga de una temperatura crítica adecuada que permita diferenciar entre secuencias de ADN mutantes y de tipo silvestre.
  • Limitado al análisis de secuencias de menos de aproximadamente 200 pb.
  • Vulnerable a errores introducidos por la polimerasa.
  • Enriquecimiento de mutaciones general variable que depende de la posición del ADN y la sustitución de nucleótidos.
  • No hay garantía de que todas las mutaciones de bajo nivel se enriquezcan preferentemente.

Historia

La técnica COLD-PCR fue descrita originalmente por Li et al. en un artículo de Nature Medicine publicado en 2008 por el grupo de investigación de Mike Makrigiorgos en el Instituto de Cáncer Dana-Farber de la Facultad de Medicina de Harvard. [ 2 ] Como se resume anteriormente, la tecnología se ha utilizado en varios experimentos de prueba de concepto y experimentos de diagnóstico para investigación médica.

Recientemente, la tecnología COLD-PCR ha sido licenciada por Transgenomic, Inc. Los términos de la licencia incluyen los derechos exclusivos para comercializar la tecnología combinada con la secuenciación de Sanger. Los planes son desarrollar aplicaciones comerciales que permitan la detección rápida y de alta sensibilidad de mutaciones de ADN somático y mitocondrial de bajo nivel. [ 5 ]

Alternativas

Existen otras tecnologías disponibles para la detección de mutaciones minoritarias del ADN, y estos métodos pueden clasificarse según su capacidad para enriquecer y detectar mutaciones conocidas o desconocidas. [ 6 ]

Una tabla que resume algunas de las alternativas a la PCR en frío.
Alternativas a la PCR en frío. La PCR en frío tiene una selectividad de 10⁻¹ a 10⁻⁴ .

Véase también

Referencias

  1. 1 2 3 Li J, Milbury CA, Li C, Makrigiorgos GM (noviembre de 2009). "La secuenciación Sanger basada en COLD-PCR de dos rondas identifica un nuevo espectro de mutaciones de bajo nivel en el adenocarcinoma de pulmón" . Human Mutation . 30 (11): 1583– 90. doi : 10.1002/humu.21112 . PMC 2784016. PMID 19760750 .  
  2. 1 2 Li J, Wang L, Mamon H, Kulke MH , Berbeco R, Makrigiorgos GM (mayo de 2008). "Reemplazar la PCR con COLD-PCR enriquece las secuencias de ADN variantes y redefine la sensibilidad de las pruebas genéticas". Nature Medicine . 14 (5): 579– 84. doi : 10.1038/nm1708 . PMID 18408729 . S2CID 205385306 .  
  3. ↑ Zuo Z, Chen SS, Chandra PK, et al. (agosto de 2009). "Aplicación de COLD-PCR para una mejor detección de mutaciones KRAS en muestras clínicas" . Modern Pathology . 22 (8): 1023–31 . doi : 10.1038/modpathol.2009.59 . PMID 19430420 .  
  4. 1 2 Li J, Makrigiorgos GM (abril de 2009). "COLD-PCR: una nueva plataforma para la detección de mutaciones altamente mejorada en cáncer y pruebas genéticas". Biochemical Society Transactions . 37 (2): 427– 32. doi : 10.1042/BST0370427 . PMID 19290875 . 
  5. ↑ Equipo editorial de Laboratorytalk (octubre de 2009). "Transgenomics licencia la tecnología COLD-PCR" . Archivado del original el 18 de julio de 2011. Consultado el 4 de marzo de 2010 .
  6. ↑ Milbury CA, Li J, Makrigiorgos GM (abril de 2009). "Métodos basados ​​en PCR para el enriquecimiento de alelos minoritarios y mutaciones" . Química Clínica . 55 (4): 632– 40. doi : 10.1373/clinchem.2008.113035 . PMC 2811432. PMID 19201784 .