Biodesulfuración

La biodesulfuración es el proceso de eliminar el azufre del petróleo crudo mediante el uso de microorganismos o sus enzimas . ^{[ 1 ]}

El petróleo crudo contiene azufre en su composición, siendo este el elemento más abundante después del carbono y el hidrógeno . ^{[ 2 ]} Dependiendo de su origen, la cantidad de azufre presente en el petróleo crudo puede variar entre 0,05 y 10 %. ^{[ 3 ]} Por consiguiente, el petróleo se puede clasificar como dulce o agrio si la concentración de azufre es inferior o superior al 0,5 %, respectivamente. ^{[ 4 ]}

La combustión del petróleo crudo libera óxidos de azufre (SO _x ) a la atmósfera , que son perjudiciales para la salud pública y contribuyen a graves efectos ambientales como la contaminación del aire y la lluvia ácida . ^{[ 2 ] [ 3 ]} Además, el contenido de azufre en el petróleo crudo es un problema importante para las refinerías , ya que promueve la corrosión de los equipos y el envenenamiento de los catalizadores de metales nobles . ^{[ 5 ]} Los niveles de azufre en cualquier yacimiento petrolífero son demasiado altos para que los combustibles fósiles derivados de él (como la gasolina, el diésel o el combustible para aviones ) se utilicen en motores de combustión sin un pretratamiento para eliminar los compuestos organosulfurados .

La reducción de la concentración de azufre en el petróleo crudo se vuelve necesaria para mitigar una de las principales fuentes de los efectos nocivos para la salud y el medio ambiente causados ​​por su combustión . En este sentido, la Unión Europea ha tomado medidas para disminuir el contenido de azufre en el diésel por debajo de 10 ppm , ^{[ 6 ]} mientras que los EE. UU. han realizado esfuerzos para restringir el contenido de azufre en el diésel y la gasolina a un máximo de 15 ppm. ^{[ 7 ]} La ​​reducción de compuestos de azufre en los combustibles derivados del petróleo se puede lograr mediante un proceso llamado desulfuración . ^{[ 8 ]} Los métodos utilizados para la desulfuración incluyen, entre otros, la hidrodesulfuración , ^{[ 9 ]} la desulfuración oxidativa , ^{[ 10 ]} la desulfuración extractiva, ^{[ 11 ]} y la extracción con líquidos iónicos . ^{[ 12 ]}

A pesar de su eficacia para reducir el contenido de azufre, los métodos convencionales de desulfuración siguen siendo responsables de una cantidad significativa de las emisiones _de CO₂ asociadas al proceso de refinación del petróleo crudo, liberando hasta 9000 toneladas métricas al año. ^{[ 13 ]} Además, estos procesos suelen requerir grandes cantidades de energía y conllevan costes elevados para las industrias que los emplean. Un proceso alternativo más ecológico y complementario a los métodos convencionales de desulfuración es la biodesulfuración. ^{[ 3 ]}

Se ha observado que existen bacterias dependientes del azufre que utilizan el azufre de compuestos que lo contienen en sus ciclos de vida (ya sea en su crecimiento o en sus procesos metabólicos ), produciendo moléculas con menor o nulo contenido de azufre . ^{[ 14 ]} En particular, se observó que los compuestos heteroaromáticos , a saber, los tiofenos y sus derivados, constituyen sustratos importantes para las bacterias. ^{[ 15 ] [ 16 ]}

La biodesulfuración es una alternativa atractiva para la eliminación de azufre, particularmente en las fracciones de petróleo crudo donde hay abundancia de heterociclos de azufre . ^{[ 17 ] [ 3 ]} Hasta la fecha, los intentos piloto para aplicaciones industriales han recurrido al uso de sistemas bacterianos completos, porque la biodesulfuración implica una cascada secuencial de reacciones por diferentes enzimas y una gran cantidad de cofactores que participan en reacciones redox ya sea con el átomo de azufre o el oxígeno molecular. ^{[ 18 ]} Sin embargo, carecían de la escalabilidad deseada para una configuración industrial debido a la baja eficiencia general de las enzimas , los mecanismos de inhibición por retroalimentación del producto y la toxicidad, o las condiciones inadecuadas para el crecimiento bacteriano a largo plazo. ^{[ 14 ]} Si bien las enzimas recombinantes libres de células serían deseables, las implementaciones conocidas todavía están muy por debajo de la eficiencia alcanzada para las de células completas. ^{[ 19 ]}

Existen dos vías principales mediante las cuales las bacterias eliminan el azufre de los compuestos que lo contienen: vías de destrucción de anillos y vías específicas de azufre. La vía de destrucción de anillos consiste en la ruptura selectiva de enlaces carbono-carbono con la liberación de pequeños sulfuros orgánicos solubles en el medio acuoso circundante, mientras que las vías específicas de azufre se basan en reacciones redox sucesivas de azufre para liberar azufre como aniones sulfuro o sulfito como subproductos. ^{[ 3 ]} Estas últimas se han considerado, por lo tanto, una vía muy prometedora para producir compuestos libres de azufre con un alto contenido calorífico , en particular en la desulfuración de heterociclos de azufre abundantes en fracciones de petróleo crudo ácido . ^{[ 1 ]}

La vía de destrucción de anillos más estudiada es la vía de Kodama, identificada inicialmente en Pseudomonas abikonensis y Pseudomonas jijani . ^{[ 21 ]} Esta vía comprende cuatro pasos principales: i) la hidroxilación sucesiva por dioxigenasas dependientes de NADH de los carbonos en uno de los anillos aromáticos, seguida de ii) la deshidrogenación del anillo por un cofactor NAD ⁺ y posteriormente iii) la oxigenación que promueve la ruptura del anillo y la formación de una ramificación piruvílica; concluyendo con iv) la hidrólisis del sustituyente piruvílico para liberar piruvato y el resto del sustrato. ^{[ 20 ] [ 22 ]} Dado que los productos finales de esta vía son compuestos de azufre solubles en agua, a menudo se la ha descartado como una vía atractiva para aplicaciones industriales, en particular por la industria petrolera. ^{[ 23 ]} La vía específica de azufre más estudiada es la vía 4S, descubierta por primera vez en la bacteria Rhodococcus erythropolis (cepa IGTS8) , ^{[ 1 ]} que se observó que eliminaba el azufre de los dibenzotiofenos y derivados en tres pasos: i) una doble oxidación del azufre (a sulfóxido y sulfona ) realizada por una monooxigenasa dependiente de flavina , seguida de ii) una escisión del enlace carbono-azufre por una segunda monooxigenasa dependiente de flavina y iii) una reacción de desulfinación a través de la cual se producen 2-hidroxibifenilo y sulfito . ^{[ 24 ]} En total, se requieren cuatro enzimas para el proceso: tres de las cuales están codificadas en los genes dszABC (las monooxigenasas dependientes de flavina DszA y DszC, y la desulfinasa DszB) y una cuarta enzima codificada en el cromosoma , DszD, que es responsable de la regeneración y el suministro del cofactor mononucleótido de flavina requerido para DszA y DszC. ^{[ 25 ] [ 26 ]} 

También se ha observado que algunas bacterias anaeróbicas pueden utilizar una vía alternativa específica del azufre para producir sulfuro de hidrógeno en su lugar. ^{[ 27 ]} Sin embargo, hasta la fecha, no se ha observado la desulfuración de fracciones como el betún , el gasóleo de vacío o el petróleo desasfaltado . ^{[ 28 ]}

La vía 4S es una vía metabólica específica del azufre de desulfuración oxidativa que convierte el dibenzotiofeno (DBT) en 2-hidroxibifenilo y sulfito . Utiliza un total de cuatro moléculas de NADH (tres requeridas por DszD para generar FMNH₂ _y una cuarta para regenerar el subproducto óxido de FMN de DszA) y tres moléculas de oxígeno , produciendo así NAD⁺ ^y agua como subproductos . ^{[ 26 ]}

DszC es la primera enzima que interviene en la vía en dos pasos secuenciales, catalizando la doble oxidación de DBT primero a DBT-sulfóxido y luego a DBT-sulfona. Requiere FMNH ₂ como cofactor , que es suministrado por DszD, y oxígeno molecular . Por esa razón, la eficiencia de esta enzima depende de la actividad de DszD y de la oxigenación ambiental. La reacción catalizada por DszC implica tres fases: 1) activación del oxígeno molecular que conduce a la formación de un intermedio de hidroperoxiflavina (C4aOOH); 2) oxidación de DBT a DBTO; y 3) deshidratación de FMN. ^{[ 29 ]} DszC es la segunda enzima menos eficiente en la vía con una k _cat particularmente baja de 1,6 ± 0,3 min ⁻¹ . ^{[ 24 ]} También se ve gravemente afectada por la inhibición por retroalimentación causada principalmente por HPBS y 2-HBP, los productos de DszA y DszB respectivamente, ^{[ 24 ]} Por esa razón, se ha seleccionado para su optimización a través de la ingeniería enzimática .

La enzima DszA es responsable del tercer paso de la vía metabólica. Cataliza la primera ruptura del enlace carbono-azufre , convirtiendo la DBT-sulfona en 2-hidroxibifenil-2-sulfinato. Al igual que DszC, DszA también requiere FMNH₂ _{proporcionado} por DszD y oxígeno molecular para su ciclo catalítico. Sin embargo, la velocidad de reacción de DszA es aproximadamente siete veces mayor que la de DszC. No obstante, al igual que DszC, sufre inhibición por retroalimentación debido al producto final de la vía, el 2-HBP.

Finalmente, la desulfinasa (DszB) rompe el enlace carbono-azufre restante en el 2-hidroxibifenil-2-sulfinato, convirtiéndolo en 2-hidroxibifenilo libre de azufre mediante un mecanismo de dos pasos. En el primer paso, que limita la velocidad de reacción, el 2-hidroxibifenil-2-sulfinato se protona por la Cys27 en su carbono electrófilo, lo que provoca la ruptura del enlace carbono-azufre y el desplazamiento del SO₂ _. En el segundo paso, una molécula de agua se desprotona por la Cys27, seguida del ataque del hidróxido al _SO₂ , formando HSO₃⁻ _. [ ^{30 ] La DszB es la enzima menos eficiente de la vía metabólica ,} lo que la convierte en un objetivo atractivo para su mejora mediante ingeniería de proteínas. ^{[ 24 ]}

La NADH-FMN oxidorreductasa (DszD) regenera el cofactor FMNH₂ _necesario para las reacciones catalizadas por DszC y DszA, mediante la oxidación de NADH a NAD⁺ ^en un mecanismo de dos pasos. El primer paso corresponde a una transferencia de hidruro desde la porción de nicotinamida del NADH al nitrógeno central en la porción de isoaloxazina del FMN oxidado, formando FMNH. En el segundo paso, una molécula de agua protona el átomo N1 del FMNH, dando _FMNH₂ . ^{[ 31 ]}

La tasa de desulfuración de las enzimas de la vía 4S de tipo silvestre es baja en comparación con la tasa necesaria para una aplicación viable en el sector industrial. Se requiere un aumento de 500 veces en la tasa global de la vía para una aplicación eficiente de este método de biodesulfuración. ^{[ 32 ]}

La evolución dirigida , el diseño racional o una combinación de ambas estrategias son algunos de los enfoques que se han aplicado para abordar la falta de eficiencia catalítica y estabilidad de las enzimas 4S. La mejor mejora de la vía 4S hasta la fecha se obtuvo mediante un enfoque de evolución dirigida en el que cepas de Rhodococcus se transformaron con un plásmido que codifica un operón dsz modificado (que codifica para DszA, DszB y DszC). Después de 40 eventos de subcultivo en un medio en el que el DBT era la única fuente de azufre, las cepas de Rhodococcus modificadas presentaron una mejora de 35 veces. ^{[ 33 ]}

La fuerte inhibición por retroalimentación de DszC también se abordó mediante una combinación de evolución dirigida y un enfoque de diseño racional para desensibilizar DszC al producto de la vía 4S, HBP . La cepa bacteriana que expresaba el mutante DszC A101K mostró mayor actividad en relación con la cepa de tipo silvestre . Además, el acoplamiento de HBP a la proteína reveló que HBP forma una interacción π con Trp327, inhibiendo así DszC. El mutante doble A101K/W327C (AKWC) resultó ser desensibilizado a bajas concentraciones de HBP y la cepa bacteriana que expresaba AKWC DszC fue 14 veces más eficiente que la cepa de tipo silvestre. ^{[ 34 ]}

La DszB, la enzima final de la vía metabólica, es también una de las más lentas, con una tasa de recambio de 1,7 ± 0,2 min⁻¹ ^, lo que la convierte en un importante cuello de botella de la vía 4S. Un enfoque de diseño racional computacional determinó un conjunto de mutaciones que podrían acelerar la transferencia de carga que ocurre en el sitio activo durante el mecanismo de reacción de la DszB , reduciendo la energía de activación de la reacción y aumentando potencialmente su tasa de recambio. ^{[ 30 ]}

La eficiencia catalítica y la termoestabilidad de DszB también se abordaron en un enfoque de mutagénesis experimental ; el mutante doble Y63F/Q65H reveló un aumento en la termoestabilidad de la enzima sin pérdida de eficiencia catalítica. ^{[ 35 ]}

También se ha seleccionado DszD para realizar mutaciones que aumenten su velocidad en el residuo Thr62. La mutación de Thr62 por residuos de Asn y Ala logró aumentar su actividad 5 y 7 veces, respectivamente. ^{[ 36 ]}

A computational study demonstrated that substitutions in position 62 of DszD sequence have a major impact in the activation energy for the hydride transfer reaction from NADH to FAD. The Thr62 mutation by an Asp residue returns the lowest activation energy from all possible mutants at this position due to the stabilization effect induced by Asp negative charge.^[37]

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