BglII

BglII es una endonucleasa de restricción de tipo II aislada de ciertas cepas de Bacillus globigii .

La función principal de las enzimas de restricción es la protección del genoma del huésped contra el ADN extraño , pero también pueden tener alguna participación en la recombinación y la transposición . ^{[ 1 ]}

Al igual que la mayoría de las enzimas de restricción de tipo II, BglII consta de dos subunidades idénticas que forman un homodímero alrededor de la doble hélice del ADN. Cada monómero tiene 223 aminoácidos y se une simétricamente a ambos lados de la secuencia de nucleótidos palindrómica única AGATCT, escindiendo el enlace fosfodiéster susceptible de escisión entre los primeros nucleótidos de adenina y guanina en ambas hebras de la molécula de ADN, creando extremos cohesivos con salientes en el extremo 5'.

Al ser una enzima de restricción de tipo II, BglII no requiere ATP para su función enzimática, sino que solo requiere la asociación con un catión metálico divalente , muy probablemente Mg ²⁺ . A diferencia de otras enzimas de restricción de su clase, se ha demostrado que BglII posee algunas características estructurales únicas, como un subdominio β-sándwich, y parece experimentar un cambio conformacional único al dimerizarse, ^{[ 2 ]} pero su estructura general y mecanismo de catálisis siguen siendo consistentes con otras enzimas de restricción de tipo II.

Las endonucleasas de restricción desempeñan un papel fundamental en las técnicas modernas de clonación molecular . Gracias a sus sitios de reconocimiento y corte únicos, las enzimas de restricción permiten cortar el ADN con precisión en ubicaciones específicas de forma predecible. Una vez cortado, el ADN suele presentar extremos cohesivos , lo que permite que el fragmento se hibride con un vector de ADN . Las enzimas ligantes se utilizan para unir covalentemente el fragmento deseado al vector para su posterior clonación.

Mecanismo

BglII cataliza la escisión del enlace fosfodiéster en la cadena principal del ADN mediante una transferencia de fosforilo al agua. ^{[ 1 ]} Los estudios sobre el mecanismo de las enzimas de restricción han revelado varias características generales que parecen ser ciertas en casi todos los casos, aunque el mecanismo real para cada enzima es muy probablemente alguna variación de este mecanismo general. Este mecanismo requiere una base para generar el ion hidróxido a partir del agua, que actuará como nucleófilo y atacará el fósforo en el enlace fosfodiéster. También se requiere un ácido de Lewis para estabilizar la carga negativa adicional del fósforo del estado de transición pentacoordinado , así como un ácido general o un ion metálico que estabilice el grupo saliente (3'-O ⁻ ).

Estructura

Aunque las endonucleasas de restricción muestran poca similitud de secuencia, las estructuras cristalinas revelan que todas comparten un núcleo α/β muy similar que consiste en una lámina β de seis hebras flanqueada por cinco hélices α , dos de las cuales median la dimerización. ^{[ 1 ]} Este núcleo contiene el sitio activo (centro catalítico) y los residuos que contactan con el ADN en el surco mayor . BglII es único porque su núcleo α/β está aumentado por un subdominio β-sándwich que tiene varias proyecciones que se extienden hacia afuera para sujetar el ADN, lo que permite a BglII rodear completamente la molécula de ADN. Esta característica atípica de BglII sugiere un movimiento de bisagra único para la unión y liberación del ADN. ^{[ 2 ]} Estudios estructurales comparativos de la enzima libre frente al complejo BglII-ADN mostraron que la enzima se abre mediante un movimiento dramático similar al de unas tijeras, acompañado de una reorganización completa de las hélices α en la interfaz del dímero. Estos estudios estructurales también revelaron que dentro de cada monómero un conjunto de residuos desciende o asciende para secuestrar o exponer alternativamente los residuos del sitio activo. Estas drásticas diferencias estructurales entre la enzima libre y la unida aún no se han observado en ninguna otra endonucleasa de restricción y posiblemente representen un nuevo mecanismo para capturar ADN que podría extenderse a otras proteínas que rodean el ADN. ^{[ 2 ]}^{[ 3 ]}

Sitio activo

Los estudios estructurales de las endonucleasas han revelado una arquitectura similar para el sitio activo con los residuos siguiendo la secuencia de consenso débil Glu/Asp-(X) _9-20 -Glu/Asp/Ser-X-Lys/Glu. El sitio activo de BglII es similar al de otras endonucleasas, siguiendo la secuencia Asp-(X) ₉ -Glu-X-Gln. En su sitio activo se encuentra un catión metálico divalente, muy probablemente Mg ²⁺ , que interactúa con Asp-84, Val-94, un oxígeno fosforilo y tres moléculas de agua. Una de estas moléculas de agua puede actuar como nucleófilo debido a su proximidad al fosforilo escindible (su orientación está fijada por un enlace de hidrógeno con el oxígeno amida de la cadena lateral de Gln-95 ^{[ 1 ]}^{[ 4 ]} ) y su contacto con el catión metálico (lo que disminuye su pK _a , promoviendo la nucleofilicidad del agua).

Véase también

BamHI , una enzima nucleasa de Bacillus amyloliquefaciens
FokI , una enzima nucleasa de Flavobacterium okeanokoites
EcoRI , una enzima nucleasa de Escherichia coli

Referencias

1 2 3 4 5 6 Lukacs CM, Kucera R, Schildkraut I, Aggarwal AK (febrero de 2000). "Comprender la inmutabilidad de las enzimas de restricción: estructura cristalina de BglII y su sustrato de ADN a una resolución de 1,5 Å". Nature Structural Biology . 7 (2): 134– 40. doi : 10.1038/72405 . PMID 10655616. S2CID 20478739 .
1 2 3 Lukacs CM, Kucera R, Schildkraut I, Aggarwal AK (febrero de 2001). "La estructura de BglII libre revela un movimiento de tijera sin precedentes para abrir una endonucleasa". Nature Structural Biology . 8 (2): 126– 30. doi : 10.1038/84111 . PMID 11175900. S2CID 25488558 .
↑ Galburt EA, Stoddard BL (febrero de 2000). "Endonucleasas de restricción: una de estas cosas no es como las demás". Nature Structural Biology . 7 (2): 89– 91. doi : 10.1038/72450 . PMID 10655603. S2CID 26817049 .
1 2 Pingoud A, Jeltsch A (septiembre de 2001). " Estructura y función de las endonucleasas de restricción de tipo II" . Nucleic Acids Research . 29 (18): 3705– 27. doi : 10.1093/nar/29.18.3705 . PMC 55916. PMID 11557805 .

Enlaces externos

Base de datos de enzimas de restricción
Entrada en la base de datos de proteínas del NCBI
Resumen de la estructura, MMDB
BglII, Biología.Kenyon.edu

[Lukacs-1] 1 2 3 4 5 6 Lukacs CM, Kucera R, Schildkraut I, Aggarwal AK (febrero de 2000). "Comprender la inmutabilidad de las enzimas de restricción: estructura cristalina de BglII y su sustrato de ADN a una resolución de 1,5 Å". Nature Structural Biology . 7 (2): 134– 40. doi : 10.1038/72405 . PMID 10655616. S2CID 20478739 .

[CML.-2] 1 2 3 Lukacs CM, Kucera R, Schildkraut I, Aggarwal AK (febrero de 2001). "La estructura de BglII libre revela un movimiento de tijera sin precedentes para abrir una endonucleasa". Nature Structural Biology . 8 (2): 126– 30. doi : 10.1038/84111 . PMID 11175900. S2CID 25488558 .

[Galburt.-3] Galburt EA, Stoddard BL (febrero de 2000). "Endonucleasas de restricción: una de estas cosas no es como las demás". Nature Structural Biology . 7 (2): 89– 91. doi : 10.1038/72450 . PMID 10655603. S2CID 26817049 .

[Pingoud-4] 1 2 Pingoud A, Jeltsch A (septiembre de 2001). " Estructura y función de las endonucleasas de restricción de tipo II" . Nucleic Acids Research . 29 (18): 3705– 27. doi : 10.1093/nar/29.18.3705 . PMC 55916. PMID 11557805 .

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