Herramienta bayesiana para el análisis de metilación

La herramienta bayesiana para el análisis de metilación , también conocida como BATMAN , es una herramienta estadística para analizar perfiles de inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP). Se puede aplicar a grandes conjuntos de datos generados mediante matrices de oligonucleótidos (MeDIP-chip) o secuenciación de nueva generación (MeDIP-seq), proporcionando una estimación cuantitativa del estado de metilación absoluto en una región de interés. ^{[ 1 ]}

MeDIP (inmunoprecipitación de ADN metilado) es una técnica experimental que se utiliza para evaluar los niveles de metilación del ADN mediante el uso de un anticuerpo para aislar secuencias de ADN metilado. Los fragmentos de ADN aislados se hibridan a un chip de microarrays (MeDIP-chip) o se secuencian mediante secuenciación de nueva generación (MeDIP-seq). Si bien esto indica qué áreas del genoma están metiladas, no proporciona niveles absolutos de metilación. Imaginemos dos regiones genómicas diferentes, A y B. La región A tiene seis CpG (la metilación del ADN en células somáticas de mamíferos generalmente ocurre en dinucleótidos CpG ^{[ 2 ]} ), tres de los cuales están metilados. La región B tiene tres CpG, todos metilados. Como el anticuerpo simplemente reconoce el ADN metilado , se unirá a ambas regiones por igual y, por lo tanto, los pasos subsiguientes mostrarán señales iguales para estas dos regiones. Esto no ofrece una visión completa de la metilación en estas dos regiones (en la región A , solo la mitad de los CpG están metilados, mientras que en la región B , todos los CpG están metilados). Por lo tanto, para obtener una visión completa de la metilación en una región determinada, es necesario normalizar la señal obtenida del experimento MeDIP con respecto al número de CpG en la región, y esto es lo que hace el algoritmo Batman . Analizando la señal MeDIP del ejemplo anterior, Batman obtendría puntuaciones de 0,5 para la región A (es decir, la región está metilada al 50 %) y de 1 para la región B (es decir, la región está metilada al 100 %). De esta forma, Batman convierte las señales de los experimentos MeDIP en niveles absolutos de metilación.

El principio fundamental del algoritmo Batman consiste en modelar los efectos de la variación en la densidad de dinucleótidos CpG y el efecto que esto tiene en el enriquecimiento de fragmentos de ADN mediante MeDIP. Los supuestos básicos de Batman son:

1. Casi toda la metilación del ADN en los mamíferos ocurre en los dinucleótidos CpG.
2. La mayoría de las regiones pobres en CpG están constitutivamente metiladas, mientras que la mayoría de las regiones ricas en CpG (islas CpG) están constitutivamente no metiladas. ^{[ 3 ]}
3. En el experimento MeDIP no existen sesgos de fragmentación (el rango aproximado de tamaños de fragmentos de ADN es de 400 a 700 pb).
4. Los errores en el microchip se distribuyen normalmente con precisión.
5. Solo los CpG metilados contribuyen a la señal observada.
6. El estado de metilación de CpG generalmente está altamente correlacionado en cientos de bases, ^{[ 4 ]} por lo que los CpG agrupados en ventanas de 50 o 100 pb tendrían el mismo estado de metilación.

Parámetros básicos en Batman:

1. C _cp : factor de acoplamiento entre la sonda p y el dinucleótido CpG c , se define como la fracción de moléculas de ADN que se hibridan con la sonda p que contienen el CpG c . 
2. C _tot  : parámetro de influencia total de CpG, se define como la suma de los factores de acoplamiento para cualquier sonda dada, lo que proporciona una medida de la densidad local de CpG.
3. m _c  : el estado de metilación en la posición c , que representa la fracción de cromosomas en la muestra en la que está metilada. m _c se considera una variable continua ya que la mayoría de las muestras utilizadas en los estudios MeDIP contienen múltiples tipos de células.

Basándonos en estas suposiciones, la señal del canal MeDIP del experimento MeDIP-chip o MeDIP-seq depende del grado de enriquecimiento de los fragmentos de ADN que se superponen a esa sonda, lo cual a su vez depende de la cantidad de unión del anticuerpo y, por lo tanto, del número de CpG metilados en esos fragmentos. En el modelo Batman, el conjunto de datos completo de un experimento MeDIP/chip, A, puede representarse mediante un modelo estadístico en forma de la siguiente distribución de probabilidad :

${\displaystyle f(A\mid m)=\prod _{p}\phi \left(A_{p}\mid A_{\text{base}}+r\sum _{c}C_{cp},\nu ^{-1}\right),}$

dónde${\displaystyle \phi }$( x | μ , σ ² ) es una función de densidad de probabilidad gaussiana . Se pueden usar técnicas bayesianas estándar para inferir f ( m | A ), es decir, la distribución de estados de metilación probables dado uno o más conjuntos de salidas de MeDIP-chip/MeDIP-seq. Para resolver este problema de inferencia, Batman usa muestreo anidado ( http://www.inference.phy.cam.ac.uk/bayesys/ ) para generar 100 muestras independientes de f ( m | A ) para cada región segmentada del genoma, luego resume el estado de metilación más probable en ventanas de 100 pb ajustando distribuciones beta a estas muestras. Las modas de las distribuciones beta más probables se usaron como llamadas de metilación finales. 

Puede resultar útil tener en cuenta los siguientes puntos al considerar el uso de Batman:

1. Batman no es un programa informático ; es un algoritmo que se ejecuta mediante la línea de comandos . Por lo tanto, no es especialmente fácil de usar y es un proceso computacionalmente complejo.
2. Al no ser un producto comercial, el soporte para usar Batman es muy limitado, más allá de lo que se indica en el manual.
3. Es un proceso bastante laborioso (el análisis de un cromosoma puede tardar varios días). (Nota: En un laboratorio gubernamental, ejecutar Batman en un conjunto de 100 matrices de metilación de ADN humano de Agilent (aproximadamente 250 000 sondas por matriz) tardó menos de una hora en completarse con el software Genomic Workbench de Agilent. Nuestro ordenador tenía un procesador de 2 GHz, 24 GB de RAM y Windows 7 de 64 bits).
4. Es necesario tener en cuenta la variación del número de copias (CNV). Por ejemplo, la puntuación de una región con un valor de CNV de 1,6 en un cáncer (una pérdida de 0,4 en comparación con lo normal) tendría que multiplicarse por 1,25 (=2/1,6) para compensar la pérdida.
5. Una de las suposiciones básicas de Batman es que toda la metilación del ADN ocurre en dinucleótidos CpG. Si bien esto suele ser así en las células somáticas de vertebrados , existen situaciones en las que hay una metilación no CpG generalizada, como en las células vegetales y las células madre embrionarias . ^{[ 5 ] [ 6 ]}