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Fragmentación del ADN apoptótico

Fragmentación del ADN apoptótico, visualizada mediante el ensayo de escalera de ADN (izquierda). Se incluye un marcador de 1 kb (centro) y ADN de control (derecha) para comparac...

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Bandas de ADN blancas sobre un fondo gris oscuro, que recuerdan a los peldaños de una escalera.
Fragmentación del ADN apoptótico, visualizada mediante el ensayo de escalera de ADN (izquierda). Se incluye un marcador de 1 kb (centro) y ADN de control (derecha) para comparación.

La fragmentación del ADN apoptótico es una característica clave de la apoptosis , un tipo de muerte celular programada . La apoptosis se caracteriza por la activación de endonucleasas endógenas , en particular la DNasa activada por caspasa-3 (CAD), [ 1 ] con la consiguiente escisión del ADN nuclear en fragmentos internucleosomales de aproximadamente 180 pares de bases  (pb) y múltiplos de estos (360, 540, etc.). La fragmentación del ADN apoptótico se utiliza como marcador de apoptosis y para la identificación de células apoptóticas, ya sea mediante el ensayo de escalera de ADN , [ 2 ] el ensayo TUNEL , [ 3 ] [ 4 ] o mediante la detección de células con contenido fraccional de ADN ("células sub G1 " ) en histogramas de frecuencia de contenido de ADN, por ejemplo, como en el ensayo de Nicoletti . [ 5 ] [ 6 ]

Mecanismo

La enzima responsable de la fragmentación del ADN apoptótico es la caspasa - DNasa activada (CAD) . Normalmente , la CAD es inhibida por otra proteína, el inhibidor de la caspasa - DNasa activada (ICAD) . Durante la apoptosis, la caspasa efectora apoptótica, la caspasa-3 , escinde la ICAD y, por lo tanto, provoca la activación de la CAD. [ 7 ]

Una doble hebra de ADN enrollada alrededor de un núcleo de proteínas histonas.
Un nucleosoma , compuesto por ADN (gris) enrollado alrededor de un tetrámero de histonas (coloreado). En la fragmentación del ADN apoptótico, el ADN se corta en la región de enlace internucleosomal , que es la parte del ADN que no está enrollada alrededor de las histonas.

La enzima CAD corta el ADN en los sitios de enlace internucleosomales entre los nucleosomas , estructuras proteicas presentes en la cromatina a intervalos de aproximadamente 180 pares de bases. Esto se debe a que el ADN normalmente está fuertemente enrollado alrededor de las histonas , las proteínas centrales de los nucleosomas. Los sitios de enlace son las únicas partes de la cadena de ADN que quedan expuestas y, por lo tanto, accesibles a la enzima CAD.

La degradación del ADN nuclear en unidades nucleosomales es una de las características distintivas de la muerte celular apoptótica. Ocurre en respuesta a diversos estímulos apoptóticos en una amplia variedad de tipos celulares. La caracterización molecular de este proceso identificó una DNasa específica (CAD, DNasa activada por caspasa) que escinde el ADN cromosómico de manera dependiente de caspasa. La CAD se sintetiza con la ayuda de ICAD (inhibidor de CAD), que actúa como chaperona específica de CAD y se encuentra formando un complejo con ICAD en células proliferantes. Cuando las células son inducidas a la apoptosis, la caspasa 3 escinde ICAD para disociar el complejo CAD:ICAD, permitiendo que CAD escinda el ADN cromosómico. Por lo tanto, las células que carecen de ICAD o que expresan una ICAD mutante resistente a caspasa no muestran fragmentación del ADN durante la apoptosis, aunque sí presentan otras características de la apoptosis y mueren.

Aunque se ha investigado mucho sobre el análisis de los eventos apoptóticos, se dispone de poca información que permita relacionar la cronología de las características morfológicas en la superficie celular y en el núcleo con la degradación bioquímica del ADN en las mismas células. La apoptosis puede iniciarse mediante una gran variedad de mecanismos en distintos tipos celulares, y la cinética de estos eventos varía considerablemente, desde unos pocos minutos hasta varios días, según el sistema celular. La presencia o ausencia de eventos apoptóticos específicos, incluida la fragmentación del ADN, depende del intervalo de tiempo en el que se investiga el proceso cinético de la apoptosis. Esto suele dificultar la identificación de células apoptóticas si las poblaciones celulares se analizan únicamente en un momento determinado, por ejemplo, tras la inducción de la apoptosis.

Antecedentes históricos

El descubrimiento de la fragmentación internucleosomal del ADN genómico en fragmentos oligonucleosomales repetitivos regulares generados por la endonucleasa dependiente de Ca/Mg se acepta como uno de los marcadores bioquímicos mejor caracterizados de la apoptosis (muerte celular programada).

En 1970, Williamson describió que el ADN citoplasmático aislado de células hepáticas de ratón después del cultivo se caracterizaba por fragmentos de ADN con un peso molecular que consistía en múltiplos de 135 kDa . Este hallazgo fue consistente con la hipótesis de que estos fragmentos de ADN eran un producto de degradación específico del ADN nuclear. [ 8 ] En 1972, Kerr , Wyllie y Currie acuñaron el término apoptosis y distinguieron este tipo de muerte celular de la necrosis basándose en características morfológicas. [ 9 ] En 1973, Hewish y Burgoyne , durante el estudio de la estructura de la subcromatina, encontraron que la cromatina es accesible a la endonucleasa Ca ++ /Mg ++ , lo que resulta en la formación de un producto de digestión con una serie regular de peso molecular similar a la descrita previamente por Williamson (1970). [ 10 ] En 1974, Williams , Little y Shipley , utilizando células expuestas a tipos de trauma muy diferentes, encontraron que durante la muerte celular, el ADN degradado en "todos los casos tenía un valor modal de entre 10(x6) y 10(x7) Dalton y el metabolismo celular es necesario para producir la degradación del ADN". Sin embargo, esta observación no indicaba "si el ataque de incisión en la molécula de ADN era aleatorio o más bien en un sitio particular, que tiene significado estructural o funcional". [ 11 ] En 1976, Scalka , Matyasova y Cejkova describieron la fragmentación internucleosomal del ADN de la cromatina linfoide irradiada in vivo . [ 12 ]

Transcurrieron seis años, desde 1972 hasta 1978/1980, hasta el descubrimiento y la evaluación de la fragmentación internucleosomal del ADN durante la muerte celular apoptótica como un sello distintivo de la apoptosis. Desde 1972 ( Kerr , Wyllie y Currie [ 9 ] ), se acepta que la muerte de linfocitos inducida por glucocorticoides es una forma de apoptosis. En 1978, Zakharyan y Pogosyan presentaron un artículo que revelaba que la degradación del ADN inducida por glucocorticoides en el tejido linfoide, el timo y el bazo de ratas ocurría en un patrón específico, produciendo fragmentos de ADN que eran electroforéticamente similares a los observados después del tratamiento de la cromatina con nucleasa microcócica, lo que indicaba que el patrón de escisión internucleosomal de la degradación del ADN ocurría durante la apoptosis. [ 13 ] [ 14 ] Así, se descubrió el primer vínculo entre la muerte celular programada/apoptosis y la fragmentación internucleosomal del ADN de la cromatina y pronto se convirtió en una característica específica de la apoptosis.

En 1980, Wyllie informó evidencia adicional de un patrón de escisión de ADN internucleosomal como una característica específica de los timocitos tratados con glucocorticoides que experimentan apoptosis. [ 2 ] El patrón de escisión de ADN internucleosomal se observó como una característica específica de la apoptosis en 1978/1980 y se ha convertido en un sello distintivo reconocido de la muerte celular programada desde entonces. En 1992, Gorczyca et al. [3] y Gavrieli et al. [4] describieron independientemente el ensayo de fragmentación de ADN basado en el uso de la transferasa de desoxinucleótidos terminales ( TUNEL ) que se convirtió en uno de los métodos estándar para detectar e identificar células apoptóticas.

ensayos de detección

La citometría de flujo se utiliza con mayor frecuencia para detectar la fragmentación del ADN apoptótico. [ 15 ] El análisis del contenido de ADN mediante citometría de flujo puede identificar células apoptóticas con ADN fragmentado como células con contenido fraccional de ADN, a menudo llamadas células sub-G 1. El ensayo de citometría de flujo que utiliza el fluorocromo naranja de acridina muestra que la fragmentación del ADN dentro de las células individuales es discontinua, lo que probablemente refleja diferentes niveles de restricción en la accesibilidad del ADN a la DNasa, por los niveles supranucleosomal y nucleosomal de la estructura de la cromatina. [ 16 ] La presencia de células apoptóticas "sub-G 1 " también puede detectarse en células prefijadas en etanol pero no después de la fijación en fijadores de reticulación como el formaldehído . Las células apoptóticas tardías S y G 2 pueden no detectarse con este método porque su contenido fraccional de ADN puede superponerse con el de las células G 1 no apoptóticas . [ 17 ] El tratamiento de las células con detergente, antes o simultáneamente con el fluorocromo de ADN, también revela la fragmentación del ADN en virtud de la presencia de células sub-G 1 o fragmentos celulares, como lo definen Nicoletti et al. [5]

La fragmentación del ADN apoptótico también puede detectarse mediante el ensayo TUNEL . El ensayo TUNEL basado en fluorocromos, aplicable a la citometría de flujo , correlaciona la detección de roturas de la cadena de ADN con el contenido de ADN celular y, por lo tanto, con la posición de la fase del ciclo celular . El ensayo TUNEL con marcaje de avidina-peroxidasa es aplicable a la microscopía de absorción de luz. Muchos kits relacionados con TUNEL están disponibles comercialmente. La fragmentación del ADN apoptótico también se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para demostrar un patrón de "escalera" a intervalos de ~180 BP . [1] La necrosis , por otro lado, se caracteriza generalmente por una fragmentación aleatoria del ADN que forma una "mancha" en los geles de agarosa.

Véase también

Referencias

  1. ^ Sakahira, H; Enari, M; Nagata, S (enero de 1998). "Escisión del inhibidor de CAD en la activación de CAD y degradación del ADN durante la apoptosis". Naturaleza . 391 (6662): 96– 9. Bibcode : 1998Natur.391...96S . doi : 10.1038/34214 . PMID 9422513 . S2CID 4329685 .  
  2. 1 2 Wyllie AH (1980-04-10). "La apoptosis de timocitos inducida por glucocorticoides se asocia con la activación de endonucleasas endógenas". Nature . 284 (5756): 555– 556. Bibcode : 1980Natur.284..555W . doi : 10.1038/284555a0 . ISSN 0028-0836 . PMID 6245367 . S2CID 4318802 .   
  3. ↑ Gorczyca, W; Bruno, S; Darzynkiewicz, R; Gong, J; Darzynkiewicz, Z (noviembre de 1992). "Roturas de la cadena de ADN que ocurren durante la apoptosis: su detección temprana in situ mediante ensayos de desoxinucleotidil transferasa terminal y traducción de muescas y prevención mediante inhibidores de la serina proteasa". Int J Oncol . 1 (6): 639– 48. doi : 10.3892/ijo.1.6.639 . PMID 21584593 . 
  4. ↑ Gavrieli, Y.; Sherman, Y.; Ben-Sasson, SA (1992). "Identificación de la muerte celular programada in situ mediante el marcaje específico de la fragmentación del ADN nuclear" . The Journal of Cell Biology . 119 (3): 493– 501. doi : 10.1083/jcb.119.3.493 . PMC 2289665. PMID 1400587 .  
  5. ↑ Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani F, Riccardi C (3 de junio de 1991). "Un método rápido y sencillo para medir la apoptosis de timocitos mediante tinción con yoduro de propidio y citometría de flujo". Journal of Immunological Methods . 139 (2): 271– 279. doi : 10.1016/0022-1759(91)90198-O . PMID 1710634 . 
  6. ↑ Riccardi C, Nicoletti I (9 de noviembre de 2006). "Análisis de la apoptosis mediante tinción con yoduro de propidio y citometría de flujo". Nature Protocols . 1 (3): 1458– 1461. doi : 10.1038/nprot.2006.238 . PMID 17406435. S2CID 4469406 .  
  7. ^ Nagata, S.; Enari, M.; Sakahira, H.; Yokoyama, H.; Okawa, K.; Iwamatsu, A. (1998). "Una ADNasa activada por caspasa que degrada el ADN durante la apoptosis y su inhibidor ICAD". Naturaleza . 391 (6662): 43– 50. Bibcode : 1998Natur.391...43E . doi : 10.1038/34112 . PMID 9422506 . S2CID 4407426 .  
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Lecturas adicionales

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