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Código de barras de ADN de algas

La identificación mediante códigos de barras de ADN de algas se utiliza comúnmente para la identificación de especies yestudios filogenéticos . Las algas forman un grupo filogen...

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La identificación mediante códigos de barras de ADN de algas se utiliza comúnmente para la identificación de especies yestudios filogenéticos . Las algas forman un grupo filogenéticamente heterogéneo, lo que significa que la aplicación de un único código de barras/ marcador universal para la delimitación de especies es inviable; por lo tanto,se utilizan diferentes marcadores/códigos de barras para este fin en diferentes grupos de algas.

diatomeas

La identificación mediante códigos de barras de ADN de diatomeas es un método para la identificación taxonómica de diatomeas , incluso a nivel de especie . Se realiza utilizando ADN o ARN, seguido de la amplificación y secuenciación de regiones específicas y conservadas en el genoma de la diatomea, para luego realizar la asignación taxonómica.

Uno de los principales desafíos para identificar diatomeas es que a menudo se recolectan como una mezcla de diatomeas de varias especies. El metabarcoding de ADN es el proceso de identificar especies individuales a partir de una muestra mixta de ADN ambiental (también llamado eDNA), que es ADN extraído directamente del medio ambiente, como en muestras de suelo o agua.

Código de barras de ADN de diatomeas

Un método recientemente aplicado es el metabarcoding de ADN de diatomeas , que se utiliza para la evaluación de la calidad ecológica de ríos y arroyos debido a la respuesta específica de las diatomeas a condiciones ecológicas particulares. Como la identificación de especies a través de la morfología es relativamente difícil y requiere mucho tiempo y experiencia, [ 1 ] [ 2 ] el metabarcoding de ADN de secuenciación de alto rendimiento (HTS) permite la asignación taxonómica y, por lo tanto, la identificación para la muestra completa con respecto a los cebadores específicos del grupo elegidos para la amplificación de ADN previa .

Hasta ahora, se han desarrollado varios marcadores de ADN, principalmente dirigidos al ARNr 18S . [ 3 ] Utilizando la región hipervariable V4 del ADN de la subunidad pequeña ribosomal (ADNr SSU), se encontró que la identificación basada en ADN era más eficiente que el enfoque clásico basado en la morfología. [ 4 ] Otras regiones conservadas en los genomas que se utilizan frecuentemente como genes marcadores son la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (rbcL), la citocromo oxidasa I (cox1, COI), [ 5 ] ITS [ 6 ] y 28S . [ 7 ] Se ha demostrado repetidamente que los datos moleculares obtenidos por el metabarcoding de ADN ambiental de diatomeas reflejan de manera bastante fiel los índices bióticos de diatomeas basados ​​en la morfología y, por lo tanto, proporcionan una evaluación similar del estado del ecosistema. [ 8 ] [ 9 ] Mientras tanto, las diatomeas se utilizan de forma rutinaria para la evaluación de la calidad ecológica en otros ecosistemas de agua dulce. [ 7 ] Junto con los invertebrados acuáticos , se consideran los mejores indicadores de perturbaciones relacionadas con las condiciones físicas, químicas o biológicas de los cursos de agua. Numerosos estudios utilizan diatomeas bentónicas para el biomonitoreo. [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] Debido a que no se encontró un código de barras de ADN de diatomeas ideal, se ha propuesto que se utilicen diferentes marcadores para diferentes propósitos. De hecho, los genes altamente variables cox1, ITS y 28S se consideraron más adecuados para estudios taxonómicos, mientras que los genes más conservados 18S y rbcL parecen más apropiados para el biomonitoreo.

Ventajas

La aplicación del concepto de código de barras de ADN a las diatomeas promete un gran potencial para resolver el problema de la identificación inexacta de especies y, por lo tanto, facilitar los análisis de la biodiversidad de muestras ambientales. [ 14 ]

Los métodos moleculares basados ​​en la tecnología NGS casi siempre conducen a un mayor número de taxones identificados cuya presencia podría verificarse posteriormente mediante microscopía óptica. [ 4 ] Los resultados de este estudio proporcionan evidencia de que el código de barras de ADN ambiental de diatomeas es adecuado para la evaluación de la calidad del agua y podría complementar o mejorar los métodos tradicionales. Stoeck et al. [ 15 ] también mostraron que el código de barras de ADN ambiental proporciona una visión más profunda de la diversidad de diatomeas u otras comunidades de protistas y, por lo tanto, podría utilizarse para la proyección ecológica de la diversidad global. Otros estudios mostraron resultados diferentes. Por ejemplo, los inventarios obtenidos mediante el método molecular se acercaron más a los obtenidos mediante el método morfológico cuando se analizan especies abundantes. [ 5 ]

El metabarcoding de ADN también puede aumentar la resolución taxonómica y la comparabilidad entre regiones geográficas, lo cual suele ser difícil utilizando únicamente caracteres morfológicos. Además, la identificación basada en ADN permite ampliar el rango de posibles bioindicadores, incluyendo grupos taxonómicos poco llamativos que podrían ser altamente sensibles o tolerantes a factores de estrés específicos. Indirectamente, los métodos moleculares también pueden ayudar a llenar las lagunas en el conocimiento de la ecología de las especies, al aumentar el número de muestras procesadas junto con una disminución en el tiempo de procesamiento (rentabilidad), así como al aumentar la exactitud y precisión de la correlación entre la presencia de especies/MOTU y los factores ambientales. [ 16 ]

Desafíos

Actualmente no existe consenso sobre los métodos de preservación y aislamiento de ADN, la elección de códigos de barras de ADN y cebadores de PCR, ni acuerdo sobre los parámetros de agrupamiento de MOTU y su asignación taxonómica. [ 16 ] Los pasos de muestreo y moleculares deben estandarizarse a través de estudios de desarrollo. [ 5 ] Una de las principales limitaciones es la disponibilidad de códigos de barras de referencia para especies de diatomeas. La base de datos de referencia de taxones bioindicadores está lejos de ser completa a pesar de los esfuerzos constantes de numerosas iniciativas nacionales de códigos de barras, muchas especies aún carecen de información de códigos de barras. Además, la mayoría de los datos de metabarcoding existentes solo están disponibles localmente y geográficamente dispersos, lo que está obstaculizando el desarrollo de herramientas útiles a nivel mundial. [ 16 ] Visco et al. [ 17 ] estimaron que no más del 30% de las especies de diatomeas europeas están representadas actualmente en bases de datos de referencia. Por ejemplo, existe una importante falta para varias especies de las comunidades fennoscandianas (especialmente diatomeas acidófilas, como Eunotia incisa ). También se ha demostrado que la identificación taxonómica con códigos de barras de ADN no es precisa por encima del nivel de especie, para discriminar variedades, por ejemplo (falta la referencia).

Otra limitación bien conocida del código de barras para la identificación taxonómica es el método de agrupamiento utilizado antes de la asignación taxonómica: a menudo conduce a una pérdida masiva de información genética y la única forma fiable de evaluar los efectos de diferentes procesos de agrupamiento y asignación taxonómica sería comparar la lista de especies generada por diferentes pipelines cuando se utiliza la misma base de datos de referencia. Esto aún no se ha hecho para la variedad de pipelines utilizados en la evaluación molecular de comunidades de diatomeas en Europa. [ 16 ] Las bases de datos taxonómicamente validadas, que incluyen vales accesibles, también son cruciales para la identificación fiable de taxones mediante NGS. [ 18 ]

Además, se ha observado que el sesgo de los cebadores suele ser una fuente importante de variación en la codificación de barras y la eficiencia de los cebadores de PCR puede diferir entre especies de diatomeas, es decir, algunos cebadores conducen a una amplificación preferencial de un taxón sobre otro. [ 16 ]

La inferencia de abundancia a partir de datos de metabarcoding se considera uno de los problemas más difíciles en el uso ambiental. [ 19 ] [ 20 ] El número de secuencias generadas por HTS no se corresponde directamente con el número de especímenes o biomasa y que diferentes especies pueden producir diferentes cantidades de lecturas, (por ejemplo, debido a diferencias en el tamaño del cloroplasto con el marcador rbcL). Vasselon et al. [ 21 ] crearon recientemente un factor de corrección de biovolumen cuando se utiliza el marcador rbcL. Por ejemplo, Achnanthidium minutissimum tiene un biovolumen pequeño y, por lo tanto, generará menos copias del fragmento rbcL (ubicado en el cloroplasto) que las especies más grandes. Sin embargo, este factor de corrección requiere una calibración extensa con el biovolumen propio de cada especie y hasta ahora solo se ha probado en unas pocas especies. Las fluctuaciones del número de copias de genes para otros marcadores, como el marcador 18S, no parecen ser específicas de la especie, pero aún no se han probado.

Regiones objetivo de las diatomeas

Los marcadores de código de barras suelen combinar regiones hipervariables del genoma (para permitir la distinción entre especies) con regiones muy conservadas (para asegurar la especificidad del organismo objetivo). Se han diseñado y utilizado con éxito varios marcadores de ADN, pertenecientes a los genomas nuclear, mitocondrial y cloroplástico ( rbcL , COI , ITS + 5.8S , SSU , 18S ...), para la identificación de diatomeas mediante NGS. [ 22 ] [ 23 ] [ 6 ]

Subunidad 18S y V4

La región del gen 18S se ha utilizado ampliamente como marcador en otros grupos de protistas [ 24 ] [ 25 ] y Jahn et al. [ 26 ] fueron los primeros en probar la región del gen 18S para el código de barras de diatomeas. Zimmerman et al. [ 7 ] propusieron un fragmento de 390–410 pb de longitud del locus del gen ARNr 18S de 1800 pb de longitud como marcador de código de barras para el análisis de muestras ambientales con HTS. y discuten su uso y limitaciones para la identificación de diatomeas. Este fragmento incluye la subunidad V4 que es la más grande y más compleja de las regiones altamente variables dentro del locus 18S. [ 27 ] Destacaron que esta región hipervariable del gen 18S tiene un gran potencial para estudiar la diversidad de protistas a gran escala pero tiene una eficiencia limitada para la identificación por debajo del nivel de especie o especies crípticas.

rbcL

El gen rbcl se utiliza para estudios taxonómicos (Trobajo et al. 2009) cuyos beneficios incluyen que rara vez hay variación intragenómica y son muy fáciles de alinear y comparar. Una biblioteca de referencia de acceso abierto, llamada R-Syst::diatom, incluye datos para dos códigos de barras (18S y rbcL). Es de libre acceso a través de un sitio web. [ 28 ] Kermmarec et al. [ 5 ] también utilizaron con éxito el gen rbcL para la evaluación ecológica de diatomeas. El marcador rbcL también es fácil de alinear y comparar.

Moniz y Kaczmarska [ 23 ] investigaron el éxito de amplificación de los marcadores SSU, COI e ITS2 y encontraron que el fragmento ITS-2 + 5.8S de 300 a 400 pb proporcionó la tasa de éxito de amplificación más alta y una buena resolución de especies. Este marcador se utilizó posteriormente para separar especies definidas morfológicamente con una tasa de éxito del 99,5 %. A pesar de este éxito de amplificación, Zimmerman et al. [ 7 ] criticaron el uso de ITS-2 debido a la heterogeneidad intraindividual. Se ha sugerido que los marcadores SSU [ 7 ] o rbcL (Mann et al., 2010) son menos heterogéneos entre individuos y, por lo tanto, más beneficiosos para distinguir entre especies.

Aplicaciones

Herramienta genética para biomonitoreo y bioevaluación

Las diatomeas se utilizan habitualmente como parte de un conjunto de herramientas de biomonitoreo que deben monitorearse según la Directiva Marco del Agua de la Unión Europea. [ 29 ] Las diatomeas se utilizan como indicador de la salud de los ecosistemas de agua dulce porque son ubicuas, se ven directamente afectadas por los cambios en los parámetros fisicoquímicos y muestran una mejor relación con las variables ambientales que otros taxones, como los invertebrados, lo que proporciona una mejor visión general de la calidad del agua. [ 30 ]

Metabarcoding de ADN ambiental en la evaluación biológica de ecosistemas acuáticos

En los últimos años, los investigadores han desarrollado y estandarizado las herramientas para el metabarcoding y la secuenciación de diatomeas, para complementar la evaluación tradicional mediante microscopía, abriendo una nueva vía de biomonitoreo para sistemas acuáticos. [ 31 ]  El uso de diatomeas bentónicas a través de un método de secuenciación de próxima generación para el biomonitoreo de ríos reveló un buen potencial en ello. [ 5 ] Muchos estudios han demostrado que el metabarcoding y el HTS (secuenciación de alto rendimiento) pueden utilizarse para estimar el estado de calidad y la diversidad en aguas dulces. Como parte de la Agencia de Medio Ambiente, Kelly et al. [ 32 ] ha desarrollado un enfoque de metabarcoding basado en ADN para evaluar las comunidades de diatomeas en ríos para el Reino Unido. Vasselon et al. [ 33 ] compararon los enfoques morfológicos y HTS para diatomeas y encontraron que el HTS dio una indicación confiable del estado de calidad para la mayoría de los ríos en términos del Índice de Contaminación Específico (SPI). Vasselon et al. [ 34 ] también aplicaron el metabarcoding de ADN de comunidades de diatomeas a la red de monitoreo de ríos en la isla tropical de Mayotte (DOM-TOM en francés).

Rimet et al. [ 35 ] también exploraron la posibilidad de utilizar HTS para evaluar la diversidad de diatomeas y demostraron que los índices de diversidad tanto de HTS como del análisis microscópico estaban bien correlacionados, aunque no eran perfectos.

El código de barras de ADN y el metabarcoding pueden utilizarse para establecer métricas e índices moleculares, que potencialmente proporcionan conclusiones ampliamente similares a las de los enfoques tradicionales sobre el estado ecológico y ambiental de los ecosistemas acuáticos. [ 36 ]

Ciencias forenses

Las diatomeas se utilizan como herramienta de diagnóstico para ahogamientos en prácticas forenses. La prueba de diatomeas se basa en el principio de la inhalación de diatomeas del agua hacia los pulmones y su distribución y depósito alrededor del cuerpo. Los métodos de ADN pueden utilizarse para confirmar si la causa de la muerte fue efectivamente ahogamiento y localizar su origen. [ 37 ] El metabarcoding de ADN de diatomeas ofrece la oportunidad de analizar rápidamente la comunidad de diatomeas presente en un cuerpo y localizar el origen del ahogamiento, así como investigar si un cuerpo pudo haber sido trasladado de un lugar a otro.

Especies crípticas y bases de datos

El metabarcoding de diatomeas puede ayudar a delimitar especies crípticas que son difíciles de identificar mediante microscopía y ayudar a completar las bases de datos de referencia comparando los conjuntos morfológicos con los datos de metabarcoding. [ 35 ] 

Otras microalgas

Las clorofitas poseen un linaje antiguo y taxonómicamente muy diverso (Fang et al. 2014), que incluye también plantas terrestres. Si bien se han descrito más de 14 000 especies basándose en criterios estructurales y ultraestructurales (Hall et al. 2010), su identificación morfológica suele ser limitada.

Se han propuesto varios códigos de barras para clorofitas para la identificación basada en ADN con el fin de sortear las problemáticas del código morfológico. Aunque el gen que codifica la citocromo oxidasa I (COI, COX) (enlace) es un código de barras estándar para animales, resultó insatisfactorio para las clorofitas porque el gen contiene varios intrones en este grupo de algas (Turmel et al. 2002). Los genes marcadores nucleares que se han utilizado para las clorofitas son el ADNr SSU, el ADNr LSU y el ITS del ADNr (Leliaert et al. 2014). [ 38 ]

macroalgas

Las macroalgas —una agrupación morfológica más que taxonómica— pueden ser muy difíciles de identificar debido a su morfología simple, plasticidad fenotípica y etapas de ciclo de vida alternativas. Por lo tanto, la sistemática e identificación de algas han llegado a depender en gran medida de herramientas genéticas/moleculares como el código de barras de ADN . [ 39 ] [ 40 ] El gen SSU rDNA es un código de barras comúnmente utilizado para estudios filogenéticos en macroalgas. [ 41 ] Sin embargo, el SSU rDNA es una región altamente conservada y generalmente carece de resolución para la identificación de especies.

En las últimas dos décadas se han desarrollado ciertos estándares para el código de barras de ADN con el objetivo de identificar especies para cada uno de los principales grupos de macroalgas. [ 42 ] [ 39 ] [ 43 ] [ 44 ] [ 45 ] El gen de la subunidad I de la citocromo c oxidasa (COI) se usa comúnmente como código de barras para algas rojas y pardas, mientras que tufA (factor de elongación de plastidios), rbcL (subunidad grande de rubisco) e ITS ( espaciador transcrito interno ) se usan comúnmente para algas verdes. [ 41 ] [ 45 ] Estos códigos de barras suelen tener entre 600 y 700 pb de longitud.

Los códigos de barras suelen diferir entre los 3 grupos principales de macroalgas (rojas, verdes y marrones) debido a su herencia evolutiva muy diversa. [ 46 ] Las macroalgas son un grupo polifilético , lo que significa que dentro del grupo no todas comparten un ancestro común reciente, lo que dificulta encontrar un gen que se conserve entre todas pero que sea lo suficientemente variable para la identificación de especies.

Regiones objetivo

Adaptado de [ 40 ]

Véase también

Aquí encontrará información detallada sobre la identificación mediante códigos de barras de ADN de diferentes organismos:

Referencias

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