Masa molar absoluta

La masa molar absoluta es un proceso utilizado para determinar las características de las moléculas .

Las primeras mediciones absolutas de pesos moleculares (es decir, realizadas sin referencia a patrones) se basaron en características físicas fundamentales y su relación con la masa molar. Las más útiles fueron la osmometría de membrana y la sedimentación .

Otro enfoque instrumental absoluto también fue posible con el desarrollo de la teoría de la dispersión de la luz por Albert Einstein , Chandrasekhara Venkata Raman , Peter Debye , Bruno H. Zimm y otros. El problema con las mediciones realizadas mediante osmometría de membrana y sedimentación era que solo caracterizaban las propiedades macroscópicas de la muestra de polímero . Además, las mediciones consumían demasiado tiempo y eran propensas a errores del operador . Para obtener información sobre una mezcla polidispersa de masas molares, se desarrolló un método para separar los diferentes tamaños. Esto se logró con la llegada de la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). La SEC se basa en el hecho de que los poros en el material de empaquetamiento de las columnas de cromatografía se pueden hacer lo suficientemente pequeños como para que las moléculas se alojen temporalmente en sus espacios intersticiales. A medida que la muestra avanza a través de una columna, las moléculas más pequeñas pasan más tiempo viajando en estos espacios vacíos que las más grandes, que tienen menos lugares para "vagar". El resultado es que una muestra se separa según su volumen hidrodinámico.${\displaystyle V_{h}}$En consecuencia, las moléculas grandes salen primero, seguidas de las pequeñas en el eluyente. Al elegir un material de relleno de columna adecuado, es posible definir la resolución del sistema. Las columnas también se pueden combinar en serie para aumentar la resolución o el rango de tamaños estudiados.

El siguiente paso consiste en convertir el tiempo de elución de las muestras en una medida de masa molar. Esto es posible porque, si se conoce la masa molar de un estándar, el tiempo de elución de este debería ser igual a una masa molar específica. Utilizando múltiples estándares, se puede desarrollar una curva de calibración de tiempo frente a masa molar. Esto es importante para el análisis de polímeros, ya que un solo polímero podría tener muchos componentes diferentes, cuya complejidad y distribución afectarían también a sus propiedades físicas. Sin embargo, esta técnica presenta limitaciones. Por ejemplo, las muestras desconocidas siempre se miden en relación con estándares conocidos, y estos estándares pueden o no tener similitudes con la muestra de interés. Las mediciones realizadas por SEC se convierten matemáticamente en datos similares a los obtenidos con las técnicas existentes.

El problema radicaba en que el sistema se calibraba según las características Vh de los polímeros estándar, las cuales no guardan relación directa con la masa molar. Si la relación entre la masa molar y Vh del estándar no coincide con la de la muestra desconocida, la calibración resulta inválida. Por lo tanto, para obtener resultados precisos, la calibración debe realizarse con el mismo polímero, de la misma conformación, en el mismo eluyente y con la misma interacción con el disolvente, ya que la capa de hidratación modifica el valor de Vh.

Benoit et al. demostraron que tener en cuenta el volumen hidrodinámico resolvería el problema. En su publicación, Benoit mostró que todos los polímeros sintéticos eluyen en la misma curva cuando se representa gráficamente el logaritmo de la viscosidad intrínseca multiplicada por la masa molar frente al volumen de elución. Esta es la base de la calibración universal, que requiere un viscosímetro para medir la viscosidad intrínseca de los polímeros. Se demostró que la calibración universal funciona para polímeros ramificados, copolímeros y polímeros estrellados.

Para una buena cromatografía, no debe existir ninguna interacción con la columna, salvo la producida por el tamaño. A medida que aumentaban las exigencias sobre las propiedades de los polímeros, también aumentaba la necesidad de obtener información absoluta sobre la masa molar y el tamaño. Esto era especialmente importante en aplicaciones farmacéuticas, donde pequeñas variaciones en la masa molar (por ejemplo, la agregación ) o la forma pueden dar lugar a una actividad biológica diferente . De hecho, estos cambios pueden tener un efecto perjudicial en lugar de beneficioso.

Para obtener la masa molar, los instrumentos de dispersión de luz deben medir la intensidad de la luz dispersada en el ángulo cero. Esto resulta poco práctico, ya que la fuente láser superaría la intensidad de la luz dispersada en el ángulo cero. Las dos alternativas son medir muy cerca del ángulo cero o medir en varios ángulos y extrapolar utilizando un modelo (Rayleigh, Rayleigh-Gans-Debye, Berry, Mie, etc.) hasta el ángulo cero.

Los instrumentos tradicionales de dispersión de luz funcionaban tomando lecturas desde múltiples ángulos, cada una medida en serie. A principios de la década de 1970 se desarrolló un sistema de dispersión de luz de bajo ángulo que permitía utilizar una sola medición para calcular la masa molar. Si bien las mediciones a ángulos bajos son mejores por razones físicas fundamentales (las moléculas tienden a dispersar más luz en direcciones de ángulos bajos que en ángulos altos), los eventos de dispersión de bajo ángulo causados ​​por el polvo y la contaminación de la fase móvil fácilmente enmascaran la dispersión de las moléculas de interés. Cuando la dispersión de luz láser de bajo ángulo (LALLS) se popularizó en las décadas de 1970 y mediados de 1980, los filtros desechables de buena calidad no estaban fácilmente disponibles y, por lo tanto, las mediciones multiángulo ganaron popularidad.

La dispersión de luz multiángulo se inventó a mediados de la década de 1980, y este tipo de instrumentos permitían realizar mediciones en diferentes ángulos simultáneamente, pero no fue hasta finales de la década de 1980 (10-12) que la conexión de detectores de dispersión de luz láser multiángulo (MALS) a sistemas SEC se convirtió en una propuesta práctica que permitía determinar tanto la masa molar como el tamaño a partir de cada sección de la fracción de polímero.

Las mediciones de dispersión de luz se pueden aplicar a polímeros sintéticos , proteínas , productos farmacéuticos y partículas como liposomas , micelas y proteínas encapsuladas. Las mediciones se pueden realizar en dos modos: sin fraccionar (modo por lotes) o en modo de flujo continuo (con SEC, HPLC o cualquier otro método de fraccionamiento por flujo ). Los experimentos en modo por lotes se pueden realizar inyectando una muestra en una celda de flujo con una jeringa o utilizando viales individuales. Estas mediciones se utilizan con mayor frecuencia para medir eventos cronometrados, como reacciones antígeno-anticuerpo o ensamblaje de proteínas . Las mediciones en modo por lotes también se pueden utilizar para determinar el segundo coeficiente virial (A2), un valor que proporciona una medida de la probabilidad de cristalización o agregación en un disolvente dado. Los experimentos de flujo continuo se pueden utilizar para estudiar material que eluye de prácticamente cualquier fuente. De forma más convencional, los detectores se acoplan a una variedad de sistemas de separación cromatográfica diferentes. La capacidad de determinar la masa y el tamaño de los materiales que se eluyen combina la ventaja del sistema de separación con una medición absoluta de la masa y el tamaño de las especies que se eluyen.

La incorporación de un detector SLS acoplado aguas abajo a un sistema cromatográfico permite utilizar la separación SEC o similar, con la ventaja de un método de detección absoluta. Los datos de dispersión de luz dependen exclusivamente de la señal de dispersión de luz multiplicada por la concentración; el tiempo de elución es irrelevante y la separación puede modificarse para diferentes muestras sin necesidad de recalibración. Además, también se puede utilizar un método de separación independiente del tamaño, como HPLC o IC. Dado que el detector de dispersión de luz depende de la masa, su sensibilidad aumenta a medida que se incrementa la masa molar. Por lo tanto, es una herramienta excelente para detectar la agregación. Cuanto mayor sea el número de agregación, mayor será la sensibilidad del detector.

Las mediciones LALS se realizan a un ángulo muy bajo, donde el vector de dispersión es prácticamente cero. LALS no requiere ningún modelo para ajustar la dependencia angular y, por lo tanto, proporciona mediciones de peso molecular más fiables para moléculas grandes. Sin embargo, LALS por sí sola no ofrece ninguna indicación del radio cuadrático medio.

Las mediciones MALS funcionan calculando la cantidad de luz dispersada en cada ángulo detectado. El cálculo se basa en la intensidad de la luz medida y la eficiencia cuántica de cada detector. Luego, se utiliza un modelo para aproximar la intensidad de la luz dispersada en ángulo cero. Esta intensidad de luz dispersada en ángulo cero se relaciona con la masa molar.

Como se mencionó anteriormente, el detector MALS también puede proporcionar información sobre el tamaño de la molécula. Esta información corresponde al radio cuadrático medio (RMS o Rg) de la molécula. Esto difiere del valor de Rh mencionado anteriormente, que considera la capa de hidratación. El radio cuadrático medio, en su forma puramente matemática, se define como la suma de los radios que componen la molécula y su masa en dicho radio.

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